崔潤(rùn)麗， 李 楠

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050031)

引 言

銀杏葉中含有多種活性物質(zhì)，包括黃酮類、氨基酸和維生素等[1-3]，其提取物可用于治療心血管疾病、老年癡呆、皮膚病、哮喘、癌癥等疾病[4-6]，其中，黃酮類化合物表現(xiàn)出較好的生理活性，在治療高血壓、冠心病、癌癥等方面療效顯著，且提取物無(wú)毒副作用。銀杏葉是可再生資源，從中提取黃酮類化合物具有明顯優(yōu)勢(shì)[7]。

水作溶劑雖溶劑無(wú)殘留，但因收率低，雜質(zhì)高，易霉變，后處理困難等原因，效果不佳，本研究以乙醇作為提取溶劑，可以改善上述情況[7-10]。微波使物質(zhì)由內(nèi)而外進(jìn)行加熱，可以有效防止表面阻力的形成，促進(jìn)有效成分順利溶入提取劑[11-15]。超聲波具有很強(qiáng)的穿透性，促進(jìn)溶劑進(jìn)入組織內(nèi)部，顯著提高有效成分溶出[16-20]。本研究首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素影響范圍，再進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確立每種提取方法最佳工藝，測(cè)定平均提取率，確定最佳提取方法和提取條件。

1 黃酮類含量測(cè)定

1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確配置0.052 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液置10 mL具塞試管中，蒸餾水為對(duì)照，用30%乙醇定容至5 mL。加入5.0 g/L亞硝酸鈉溶液0.3 mL，旋渦振蕩混勻，靜置6 min。加0.3 mL 100 g/L硝酸鋁溶液，迅速振蕩，靜置6 min。加入4 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容到100.0 mL，混勻。靜置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

洗凈的銀杏葉于60 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎后放入干燥器中備用。

1.2.2 黃酮類化合物提取

取4.0 g銀杏葉粉末于錐形瓶，加不同體積和濃度的乙醇，采用不同方法提取,超聲波輔助提取不同時(shí)間。本研究均將提取物定容到25 mL，用于測(cè)定吸光度。

1.2.3 黃酮含量測(cè)定

取銀杏葉粉4.0 g，70%乙醇抽提至無(wú)色，抽濾，定容。按1.1方法測(cè)定吸光度，總黃酮含量為5.74%。

1.2.4 總黃酮提取率的計(jì)算

提取液用70%乙醇定容至50 mL，按1.1方法測(cè)定吸光度，按式(1)計(jì)算提取率。

(1)

2 不同方法提取總黃酮

2.1 索氏提取法

將銀杏葉粉末4.0 g，放入墊有脫脂棉的濾紙筒，將濾紙筒放入索氏提取器，按不同條件加入乙醇，不同溫度下提取5 h，抽濾，定容至25 mL作為待測(cè)液。

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用乙醇索氏提取法提取黃酮的文獻(xiàn)很多，從中選取合適的提取溫度、液固比(v/w)、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳提取條件。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9(34)正交表。以乙醇含量、溫度、液固比 (v/w)作為影響因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、實(shí)驗(yàn)溫度的極差分別為14.9、8.4和5.5，因此，乙醇含量對(duì)提取率的影響最大。最佳提取條件為A3B2C2。

2.1.3 最佳提取條件

按照A3B2C2即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度70 ℃，液固比15∶1條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，提取率分別為82.1%、82.8%、82.6%，平均提取率為82.5%。

2.2 微波輔助提取法

將銀杏葉粉末4.0 g，置消解罐中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入乙醇，控制一定溫度，在不同微波功率下提取一定時(shí)間，抽濾，定容到25 mL作為待測(cè)液。

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 微波功率的影響

在液固比為15∶1，實(shí)驗(yàn)溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%條件下，提取6 min，進(jìn)行功率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2。

圖2 微波功率影響圖

圖2顯示，微波功率在200 W～300 W，提取率隨著功率增加而增加， 高于300 W后，提取率明顯下降，最佳功率在300 W左右。

2.2.1.2 液固比的影響

在微波功率為300 W，溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%條件下，提取6 min，進(jìn)行液固比對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3。

圖3 液固比影響圖

圖3顯示，液固比小于15∶1時(shí)提取率明顯提高，當(dāng)液固比進(jìn)一步增大，提取率提高緩慢，溶劑消耗量顯著增加，綜合考慮，液固比為15∶1為最佳。

2.2.1.3 提取時(shí)間的影響

在微波功率300 W，溫度30 ℃，乙醇含量70%，液固比15∶1條件下，進(jìn)行時(shí)間對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4。

圖4 提取時(shí)間影響圖

由圖4可知，隨著微波時(shí)間增加提取率迅速增加，但當(dāng)超過(guò)8 min后，提取率增加緩慢，時(shí)間延長(zhǎng)，能耗增加，綜合考慮，提取時(shí)間8 min為最佳。

2.2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

在微波功率300 W，溫度30 ℃，液固比15∶1，微波8 min條件下，進(jìn)行乙醇含量對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇含量影響圖

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，提取率隨著濃度增加而提高，超過(guò)70%時(shí)提取率下降。主要原因是，高濃度乙醇脫水作用增加。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9(34)正交表。以微波功率、液固比(v/w)、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

液固比、 微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間的極差分別為7.4、6.4、5.4和4.3，液固比是最大影響因素。最佳提取條件為A2B3C3D2。

2.2.3 最佳提取條件實(shí)驗(yàn)

按照A2B3C3D2，即微波功率300 W，液固比15∶1，提取時(shí)間10 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，提取率為85.3%、85.6%、85.4%，平均提取率為85.4%。

2.3 超聲波輔助提取法

取銀杏葉粉末4.0 g，放入燒杯中，溫度30 ℃條件下，進(jìn)行乙醇濃度、微波功率、提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)，提取物抽濾，定容到25 mL作為待測(cè)液。

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 超聲波功率的影響

在液固比15∶1，溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取10 min條件下，進(jìn)行功率對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6。

圖6 超聲波功率影響圖

由圖6可知，超聲波功率240 W～280 W提取率增加顯著，超過(guò)280 W～320 W下降明顯，超聲波功率應(yīng)控制在280 W左右。

2.3.1.2 液固比的影響

在超聲功率280 W，溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取10 min條件下，進(jìn)行液固比對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7。

圖7 液固比影響圖

提取率隨著液固比增加顯著，但當(dāng)液固比大于15∶1以后，提取率下降迅速，主要是由于，超聲破壞黃酮類結(jié)構(gòu)所致，液固比為15∶1為最佳。

2.3.1.3 提取時(shí)間的影響

在超聲功率280 W，溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比15∶1條件下，進(jìn)行提取時(shí)間對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8。

圖8 提取時(shí)間影響圖

隨著超聲波時(shí)間增加提取率逐漸增加，但10 min以后，提取率明顯下降，提取時(shí)間應(yīng)控制在10 min左右。

2.3.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

在超聲功率280 W，溫度30 ℃，液固比15∶1，提取10 min條件下，進(jìn)行乙醇含量對(duì)提取率影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9。

圖9 乙醇含量影響圖

乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取率最大，當(dāng)濃度進(jìn)一步增加提取率反而下降，可能與高濃度乙醇脫水作用增加有關(guān)，因此，乙醇含量70%最佳。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9(34)正交表。以超聲波功率、液固比(v/w)、提取時(shí)間、乙醇含量作為影響因素，進(jìn)行3水平正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲功率的極差分別為26.1、7.2、7.0、5.8，提取率影響最大的是液固比。最佳提取條件為A3B1C2D2。

2.3.3 最佳提取條件實(shí)驗(yàn)

按照A3B1C2D2即超聲波功率320 W，提取10 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比15∶1， 30 ℃條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮提取率分別為91.3%、91.6%、91.7%，平均提取率為91.5%。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度等單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件為索氏提取法：溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液固比15∶1，提取率為82.5%；微波輔助提取法:微波功率380 W，乙醇含量60%，液固比15∶1，提取10 min，提取率為85.4%；超聲波輔助提取法:超聲波功率320 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，溫度30 ℃，液固比15∶1，提取10 min，提取率為91.5%。

以上結(jié)果顯示:超聲波法具有明顯優(yōu)勢(shì)，該方法10 min提取率比乙醇浸提5 h的提取率高9%，比微波提取法高6.1%，因此，從環(huán)保、省時(shí)和節(jié)能等多方面分析，超聲輔助提取是較理想的提取方法。