向候君,蔡普默,季清娥,楊燕川,王 波,陳家驊

福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建 福州 350002

在昆蟲體內(nèi)通常存在多種微生物，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等，它們能夠影響昆蟲的某些重要生命活動(dòng)過(guò)程[1,2]。研究昆蟲腸道微生物不僅利于開發(fā)利用昆蟲資源和害蟲防治，而且能從昆蟲腸道中獲得某些特殊功能的細(xì)菌資源[3]，應(yīng)用于植物病害的防治，控制動(dòng)物疫病的傳播等[4]。昆蟲內(nèi)微生物與宿主的相互關(guān)系已逐漸成為昆蟲學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，此外，各種生物學(xué)技術(shù)在昆蟲學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域的大量應(yīng)用，也極大推動(dòng)了昆蟲體內(nèi)微生物種類、多樣性、功能、與宿主互作及協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的研究[1]。

由于微生物個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分類鑒定除了采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征，還應(yīng)尋找新的特征作為其分類鑒定依據(jù)[5]。人們對(duì)昆蟲體內(nèi)微生物的鑒定，最初以傳統(tǒng)方法如生物分型、血清分型、抗微生物易感性試驗(yàn)、免疫印跡法、噬菌體分型和多位點(diǎn)酶電泳法等為主。這些方法統(tǒng)稱為表型分類法，是以菌體的表現(xiàn)類型為依據(jù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類和鑒定[6]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，建立了一種新的分類系統(tǒng)—遺傳型分類法，主要原理是對(duì)微生物的染色體DNA進(jìn)行直接分析或?qū)ζ淙旧w外DNA片段進(jìn)行分析，進(jìn)而從遺傳進(jìn)化角度去認(rèn)識(shí)細(xì)菌，從分子水平對(duì)它們進(jìn)行分類與鑒定[6]。目前，昆蟲內(nèi)共生菌的功能研究也進(jìn)入了一個(gè)新的階段。近幾年，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及新一代高通量測(cè)序工具和分析軟件等，以及基因組學(xué)工具的進(jìn)步及發(fā)展，促進(jìn)了宿主昆蟲共生機(jī)制及其內(nèi)共生菌研究的發(fā)展，為從微觀角度研究共生菌與宿主昆蟲種群形成、擴(kuò)散的共生機(jī)制提供了便利[7]。本文旨在對(duì)昆蟲內(nèi)共生菌鑒定的研究方法及其應(yīng)用研究進(jìn)行綜述，為研究昆蟲微生物的生物群落及功能機(jī)制等研究提供技術(shù)參考。

1 昆蟲體內(nèi)微生物的鑒定方法

1.1 傳統(tǒng)的鑒定方法

在分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展之前，對(duì)昆蟲微生物的鑒定，主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定法，即宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察，以及生理生化實(shí)驗(yàn)如糖類、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn)、胺鹽和有機(jī)酸鹽利用試驗(yàn)、毒性酶類試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)等對(duì)其進(jìn)行逐級(jí)鑒定[6]，之后再根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等理論依據(jù)對(duì)得到的菌種進(jìn)行分類鑒定[6,8]。如孟祥杰等[9]通過(guò)平板法從六斑異瓢蟲Aiolocaria mirabilis的雌性成蟲腸道中分離到5株細(xì)菌，通過(guò)觀察菌落形態(tài)、細(xì)胞的生物學(xué)特征和生理生化特征等，分別鑒定為地桿菌屬Terrabacter、李斯特菌屬Listeria、纖維單胞菌屬Cellulomonas、短小桿菌屬Curtobacterium和皮桿菌屬Demabacter細(xì)菌。

微生物鑒定方法包括分子遺傳學(xué)鑒定法和表型鑒定法兩類，其中表型鑒定法是對(duì)細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞組分水平的鑒定，包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法[10,11]。為了改革和優(yōu)化傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)，一些簡(jiǎn)便、快速、自動(dòng)化的鑒定技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)，不但普及了鑒定技術(shù)，而且還大大提高了工作效率。具有代表性的如應(yīng)用于各種細(xì)菌鑒定的“API”系統(tǒng)、“Biolog”系統(tǒng)[11]。

API鑒定系統(tǒng)：該系統(tǒng)包括15種鑒定條，可鑒定包括腸桿菌(API20E、API 10S、RapiD 20E)、革蘭陰性桿菌(API 20NE)、厭氧菌(API 20A)、彎曲菌(API Campy)、棒狀桿菌(API Coryne)、李斯特菌(API Listeria)、奈瑟氏-嗜血桿菌(APINH)、葡萄球菌(API Staph)、鏈球菌(API 20Strep)、酵母菌(API 20CAUX、API Candida)、乳桿菌和芽胞桿菌(API 50CH)等600種以上的細(xì)菌[12]。從橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis3個(gè)種群(實(shí)驗(yàn)室正常喂養(yǎng)種群、實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌糖水喂養(yǎng)種群、野生種群)成蟲腸道中分離培養(yǎng)的600株細(xì)菌中得到53種不同細(xì)菌遺傳型，在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后對(duì)其菌落特征進(jìn)行觀察，主要分別從細(xì)菌形狀、菌落形態(tài)、顏色、透明度、革蘭氏染色、芽孢有無(wú)等方面進(jìn)行區(qū)別鑒定[13]，之后采用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)并由上海長(zhǎng)源科學(xué)技術(shù)有限公司代理銷售的ID32E腸桿菌科和其它革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)及API 50CHB芽孢桿菌屬鑒定系統(tǒng)對(duì)其成蟲腸道可培養(yǎng)微生物進(jìn)行鑒定，最終分屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)等3個(gè)科。其中腸桿菌科是腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌種類[13,14]。

Biolog微生物鑒定系統(tǒng)由濁讀儀、讀數(shù)儀、軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)、微孔鑒定板組成，與計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)。對(duì)結(jié)果的鑒定需要考慮可能性(Probability)、相似性(Similarity)、位距(Distance)這3個(gè)參數(shù)；通過(guò)相似性(SIM)，位距(DIST)和可能性(PROB)值與數(shù)據(jù)庫(kù)中的ID比較，確定被鑒定的微生物的屬種。Biolog微生物鑒定系統(tǒng)的基本步驟：BUY培養(yǎng)基的配制；接種培養(yǎng)；平板劃線；濁度調(diào)整；接種鑒定板；讀取數(shù)據(jù)；結(jié)論與數(shù)據(jù)分析[5]。利用Biolog-Eco方法，對(duì)以抗蟲轉(zhuǎn)cry1Ab基因粳稻(KMD1/KMD2)及其對(duì)照(秀水11)為食的褐飛虱腸道微生物群落多樣性進(jìn)行比較研究，以評(píng)價(jià)其對(duì)該飛虱腸道微生物多樣性的影響。室內(nèi)和田間的研究結(jié)果均表明，以KMD1為食時(shí)，其微生物群落的平均顏色變化率（AWCD）明顯高于以KMD2和對(duì)照為食[15]。

1.2 分子生物學(xué)方法

依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)手段，且由于人們的認(rèn)知條件限制，許多微生物尚難以被分離培養(yǎng)，因此對(duì)于揭示昆蟲微生物區(qū)系的多樣性有很大的局限性[4,6,16,17]。通過(guò)分子生物學(xué)方法研究的結(jié)果表明，人們只分離出了自然界0.1%～1.0%的微生物，99%以上的環(huán)境微生物是無(wú)法獲得純培養(yǎng)的[4,18,19,20]，因此以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)對(duì)微生物進(jìn)行的研究結(jié)果并不能完全代表其真實(shí)的情況。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲微生物學(xué)研究中，即包括基于核酸水平的鑒定，對(duì)細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析的分子遺傳學(xué)鑒定法[10,21]。目前，研究昆蟲微生物多樣性的分子生物學(xué)方法主要包括：變性梯度凝膠電泳（DGGE）、16S rRNA基因技術(shù)、分子雜交技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、擴(kuò)增性核糖體DNA限制性酶切片段分析（ARDRA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）以及細(xì)菌宏基因組測(cè)序技術(shù)等，為不可培養(yǎng)微生物的菌群結(jié)構(gòu)分析提供了有力的手段[22,23]。

1.2.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 該技術(shù)是利用尿素和甲酞胺兩種變性物質(zhì)制成一種由低至高濃度的變性膠，雙鏈DNA在變性物質(zhì)的作用下變性，不同堿基組成的DNA雙螺旋在電泳時(shí)會(huì)在不同的變性劑濃度中發(fā)生變性，導(dǎo)致其電泳遷移速率降低，于是DNA分子停留在凝膠中不同的位置，得以分離[5,13,27]。主要步驟：先提取樣品總DNA，對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行PCR-DGGE凝膠電泳，相同長(zhǎng)度的不同的核酸序列經(jīng)電泳后在聚丙稀酰胺膠上分離開來(lái)?？筛鶕?jù)條帶的位置和亮度估算原始樣品中DNA的相對(duì)含量，或者通過(guò)割膠獲取目的DNA條帶，然后對(duì)DNA進(jìn)行PCR回收后連接到T載體上，篩選陽(yáng)性克隆子后再通過(guò)測(cè)序進(jìn)行分析，從而推斷出微生物的群落結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)菌群[24]。王甸洪等[25]運(yùn)用PCR-DGGE和16S rRNA文庫(kù)相結(jié)合的方法研究了螺旋粉虱Aleurodicus dispersus體內(nèi)細(xì)菌多樣性和主要優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)。通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)，在小菜蛾腸道中分離到15個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的16S rRNA序列，通過(guò)序列比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析，這些細(xì)菌序列屬于3個(gè)門6個(gè)屬以及3種環(huán)境中不明確樣本（Uncultured bacteria）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，變形菌門的沙雷氏菌（Serratia）在幼蟲腸道中分布最廣泛，Pseudomonas和Serratia在腸道細(xì)菌數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)地位[16]。同樣通過(guò)這種方法對(duì)桑粒肩天牛Apriona germari不同采集時(shí)間的樣品進(jìn)行研究，結(jié)果表明腸道菌種類差異很大[26]。

1.2.2 16S rRNA基因技術(shù) 該技術(shù)是通過(guò)將獲得的微生物16S rRNA基因的序列信息與已知菌種的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)未知微生物進(jìn)行分類和鑒定。主要有三個(gè)步驟：首先是獲得基因組DNA，接著是擴(kuò)增16S rRNA基因片段，最后就是測(cè)序分析16S rRNA基因序列[27]。在對(duì)褐飛虱Nilaparvata lugens體外培養(yǎng)細(xì)菌類內(nèi)共生菌的研究中，用普通培養(yǎng)基分離純化后的菌株用菌類16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與粉虱科的殺雄菌屬內(nèi)共生菌（Arsenophonussp.）相似度達(dá)99%[28]。有研究采用16S rDNA基因文庫(kù)技術(shù)和Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了自然種群澤蘭實(shí)蠅Procecidochares utilis幼蟲腸道內(nèi)的細(xì)菌群落及多樣性?？偣沧⑨尩?3個(gè)門，4個(gè)綱，6個(gè)目，7個(gè)科，10個(gè)屬和4個(gè)種。其中變形菌門(Proteobacteria)的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，占99%；在屬分類階元上，沃爾巴克氏體屬（Wolbachia）占45%，是優(yōu)勢(shì)屬[29]。分離于小菜蛾腸道的80株可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA基因片段經(jīng)測(cè)序，可初步確定細(xì)菌主要分布在腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)，黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)等五個(gè)科。所占比例達(dá)到76.25%，是腸道可培養(yǎng)微生物最優(yōu)勢(shì)菌群[30]。

1.2.3 分子雜交技術(shù) 該技術(shù)是利用待檢測(cè)樣品的16S rRNA基因和特定已知序列分子探針進(jìn)行雜交，以確定樣品中微生物群落組成及豐度。主要方法包括：芯片雜交、熒光原位雜交以及原位雜交等[22]。其基本的操作步驟：先對(duì)序列進(jìn)行排隊(duì)，序列特異性鑒定，然后互補(bǔ)核酸探針的合成和標(biāo)記，最后進(jìn)行探針特異性和測(cè)定敏感性評(píng)價(jià)和優(yōu)化[31]。采用基因芯片技術(shù)研究人類致病菌瘧原蟲Plasmodium falciparum攜帶者岡比亞按蚊Anopheles gambiae的腸道菌區(qū)系組成及腸道細(xì)菌與瘧原蟲P.falciparum之間的關(guān)系，結(jié)果表明腸道微生物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)A.gambiae的某些免疫基因?qū)汞懺x的感染[32]。采用熒光原位雜交技術(shù)，研究臭椿Parastnachia japonensi腸道共生菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)P.japonensis體內(nèi)存在一種?-變形菌綱細(xì)菌的專性共生菌，并且P.japonensis中腸后端有一個(gè)特化的結(jié)構(gòu)，共生菌專性棲居在該共生體器官內(nèi)[33]。

1.2.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP） 該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶能識(shí)別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，不同種群的生物個(gè)體DNA序列存在差別，因此可檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小?；静襟E：首先擴(kuò)增一基因或基因片段，然后用限制性內(nèi)切酶酶切該擴(kuò)增片段,最后通過(guò)電泳酶切片段以區(qū)分[24,34]。通過(guò)該技術(shù)已經(jīng)對(duì)昆蟲腸道(包括金龜子腸道、白蟻腸道等)等生境中的微生物群落組成和多樣性進(jìn)行了一定的研究[35,36]。用該方法對(duì)桑粒肩天牛腸道微生物的16S rDNA擴(kuò)增片段分析建立的傳統(tǒng)克隆文庫(kù)，根據(jù)不同的酶切指紋圖譜將175個(gè)克隆子歸為48個(gè)不同的分類操作單元(OTUs)。通過(guò)各選一個(gè)分類操作單元，作為一個(gè)代表克隆子進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，可知這48個(gè)OTUs分屬于22個(gè)不同的細(xì)菌屬，其中優(yōu)勢(shì)菌分屬于腸球菌屬(Entorococcus)，乳球菌屬(Lactococcus)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，分別占所檢測(cè)克隆總數(shù)的17.1%，19.4%和24.6%[26]。利用細(xì)菌的16S rRNA-RFLP方法分析柏大蚜Cinara tujafilina和松大蚜C.pinitabulaeformis的結(jié)果表明：其體內(nèi)細(xì)菌組成主要是初級(jí)內(nèi)共生菌Buchnera aphidicola和次級(jí)內(nèi)共生菌Candidatus Serratia symbiotica，并且分別所占的比例也有差異。在柏大蚜中，B.aphidicola占37%，C.Serratia symbiotica占56%，還有少量的腸桿菌屬Enterobacter占7%；在松大蚜中，B.aphidicola占66.7%，C.Serratia symbiotica占33.3%[23]。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR） 該技術(shù)是根據(jù)樣本核酸擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)成正比，且反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物(熒光探針)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，通過(guò)熒光量的檢測(cè)來(lái)測(cè)定樣本核酸量[40]。主要步驟是將熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)放到PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR的進(jìn)程，然后通過(guò)其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[27,38,39]。楊義婷[40]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)方法，檢測(cè)不同發(fā)育歷期的煙粉虱Bemisia tabaci體內(nèi)的R.bellii菌的拷貝數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)在煙粉虱發(fā)育過(guò)程中，R.bellii菌的拷貝數(shù)會(huì)在羽化初期發(fā)生顯著性增長(zhǎng)，隨后下降，但第六天又開始發(fā)生顯著上升趨勢(shì)，從而明確了優(yōu)勢(shì)種菌在煙粉虱發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、存活率、抱卵量和后代性比等方面的影響。此技術(shù)也應(yīng)用于昆蟲檢疫及昆蟲的分類鑒定等方面的研究，例如B型煙粉虱的鑒定[41]。

1.2.6 擴(kuò)增性核糖體DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)該技術(shù)主要作用于核糖體DNA序列，不同物種rDNA序列不盡相同，使用相同限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行酶切，則會(huì)產(chǎn)生不同數(shù)量、不同長(zhǎng)度的片段，從而將不同微生物區(qū)別開來(lái)[22]?；静襟E：采用特異限制性內(nèi)切酶對(duì)一定長(zhǎng)度的DNA片段進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和檢測(cè)，從而分析微生物的多樣性[42]。采用ARDRA技術(shù)研究暗黑鰓金龜Holotrichia parallela幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)纖維素分解菌的多樣性，結(jié)果可將分離得到的207株菌株歸為21種不同的類型[43]。從思茅松毛蟲Dendrolimu kikuchii4齡幼蟲腸道環(huán)境中分離、純化、培養(yǎng)，可獲得11株好氧細(xì)菌的菌株，以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行ARDRA多態(tài)性分析，在84%的相似水平上可分成6大類群，多樣性豐富[44]。

1.2.7 宏基因組測(cè)序技術(shù) 該技術(shù)是對(duì)于一些不可以培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究的新技術(shù)[40,45]?；静襟E是通過(guò)高通量測(cè)序與分析，對(duì)微生物種群的DNA片段進(jìn)行拼接重組，并與公布數(shù)據(jù)庫(kù)中其他菌類的信息比對(duì)，即可預(yù)測(cè)該菌種可能存在的功能[40]。運(yùn)用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)不同生物型的豌豆蚜進(jìn)行研究，鑒定出了21種共生菌，其中8種占主導(dǎo)地位，共生菌之間的復(fù)雜聯(lián)系是導(dǎo)致寄主植物?；缘闹匾蛩豙46]。夏曉峰[47]測(cè)定了小菜蛾幼蟲、蛹和成蟲的中腸微生物宏基因組，宏基因組分析表明小菜蛾中腸微生物由變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、硝化螺旋菌門Nitrospirae，以及古細(xì)菌的廣古菌門Euryarchaeota,真菌的擔(dān)子菌門Basidiomycota和子囊菌Ascomycota組成，占整個(gè)中腸微生物的99%以上。

2 昆蟲體內(nèi)共生菌的研究方法在研究宿主的生理功能中的應(yīng)用

昆蟲內(nèi)共生菌是昆蟲與微生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的蟲菌共生體系中的重要部分，對(duì)宿主的生長(zhǎng)與發(fā)育起著非常重要的作用。昆蟲體內(nèi)組織為內(nèi)共生菌的生存繁殖提供了理想的物質(zhì)及環(huán)境條件，昆蟲內(nèi)共生菌主要具有調(diào)節(jié)生殖生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)平衡和抵御病原侵害等作用[4,48]。

2.1 共生菌種群變化與抗藥性的關(guān)系

采用PCR-DGGE的分子生物學(xué)的技術(shù)對(duì)敏感的品系、抗高效的氯氰菊酯品系的德國(guó)小鐮Blattella germanica的腸道菌進(jìn)行分析，通過(guò)敏感與抗性品系的德國(guó)小鐮腸道的圖譜差異，電泳條帶的數(shù)量和遷移率的不同，得知在外界殺蟲劑的作用下能夠顯著的改變德國(guó)小鐮的體內(nèi)微生物的種類及種群數(shù)量。并且在去除腸道菌后的德國(guó)小鐮幼蟲的孵化數(shù)、幼蟲的羽化率均會(huì)降低，所產(chǎn)后代的雌性個(gè)體比例下降，繁殖力與敏感品系相比呈下降的趨勢(shì)，表現(xiàn)出繁殖不利性。腸道菌除了影響德國(guó)小鐮的生殖方面，對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)育也有顯著的影響，去除腸道菌的德國(guó)小鐮的幼蟲死亡率較高，且從幼蟲到成蟲期間的生長(zhǎng)的歷期會(huì)有所延長(zhǎng)[49]。

2.2 共生菌與昆蟲免疫系統(tǒng)的互作研究

在昆蟲共生細(xì)菌與病毒的關(guān)系上，有研究表明，在黑腹果蠅中Wolbachia能夠提高宿主對(duì)許多病毒的抵抗能力，并且在其他昆蟲中Wolbachia可能也具有類似功能[50]。利用攜帶共生菌的線蟲侵染、鎢針沾共生菌菌懸液針刺和人工飼喂共生菌這3種方法將S.nematodiphilaR187植入黑腹果蠅Drosophila melanogaster血腔或腸道；通過(guò)果蠅死亡率、細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，結(jié)合果蠅體液免疫信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控的2種抗菌肽—Diptericin和Drosomycin表達(dá)的qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)H.rugaoensis攜帶共生菌和共生菌針刺侵染后同時(shí)激活果蠅的Toll和Imd途徑；熒光定量PCR結(jié)果顯示侵染過(guò)程中Diptericin和Drosomycin的相對(duì)表達(dá)均呈先上升再逐漸減弱的趨勢(shì)；結(jié)果證明S.nematodiphilaR187侵染果蠅時(shí)，Toll途徑和Imd途徑都被激活；果蠅抵抗S.nematodiphilaR187入侵的體液免疫信號(hào)通路主要是其Imd途徑；S.nematodiphilaR187可能采用免疫逃避機(jī)制從其腸道成功侵染果蠅[51]。

2.3 共生菌與昆蟲營(yíng)養(yǎng)代謝的相互關(guān)系

有研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)華山松大小蠢Dendroctonus armandi的微生態(tài)組成、不同發(fā)育階段和雌雄成蟲間真菌群落多樣性動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究，揭示了華山松大小蠢腸道真菌群落多樣性差異，并且發(fā)現(xiàn)真菌群落組成中的酵母菌(假絲酵母Candida)和絲狀真菌(藍(lán)變真菌Ophiostoma）可能直接或間接幫助華山松大小蠢克服寄主樹木抗性，并為其發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)和能量補(bǔ)充[20]。張來(lái)麗等[52]研究發(fā)現(xiàn)白蟻腸道微生物對(duì)降解木質(zhì)素起著主導(dǎo)作用，木質(zhì)素的完全降解是真菌，細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果。

2.4 共生菌種群對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和壽命的影響

利用16S rDNA-454焦磷酸測(cè)序技術(shù)調(diào)查了水虻各個(gè)連續(xù)生命階段的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和變形菌門最具優(yōu)勢(shì)的菌門；經(jīng)過(guò)產(chǎn)卵地點(diǎn)選擇測(cè)試（OSP）后，確定起關(guān)鍵作用的是一個(gè)細(xì)菌復(fù)合體（BSF-4），其中有4株菌，對(duì)水虻產(chǎn)卵都具有吸引作用；通過(guò)對(duì)蟲卵進(jìn)行處理獲得無(wú)菌幼蟲，之后測(cè)定在喂食相同無(wú)菌人工飼料條件下無(wú)菌幼蟲與正常幼蟲生活史特性的差異。結(jié)果顯示，無(wú)菌幼蟲預(yù)蛹率和存活到成蟲階段的比率均顯著低于正常幼蟲[53]。采用PCR-DEEG和超級(jí)PCR等技術(shù)對(duì)地中海實(shí)蠅（Ceratitis capitata）腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下接種高水平綠膿桿菌會(huì)減少地中海實(shí)蠅壽命，而接種腸桿菌科卻能增加地中海實(shí)蠅壽命[54]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

研究表明，內(nèi)共生菌可為宿主提供食物中缺乏的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并協(xié)助消化食物和解毒[7,55,56,57]，許多微生物含有多種酶系統(tǒng)，可通過(guò)協(xié)助宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝，提供食物中缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并彌補(bǔ)食物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不足；以及分泌抗菌肽、毒素等物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)宿主昆蟲自身防御病原微生物和寄生物的能力[58,59,60,61]。同時(shí)，也可以調(diào)控植物生理反應(yīng)，增強(qiáng)宿主的抗逆性，抑制植物對(duì)宿主的不利影響，也可以通過(guò)對(duì)抗逆性基因的精確表達(dá)調(diào)控來(lái)增強(qiáng)宿主抗藥性等[7,45]。昆蟲的生理活動(dòng)與體內(nèi)共生微生物或腸道微生物之間有著密切的聯(lián)系，在探索昆蟲微生物及共生微生物的功能研究中，分析微生物的生物群落及多樣性必不可少，選擇合適的分析昆蟲微生物群落的方法就尤為重要。

本部分將對(duì)文中提到的各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較（附表1），并對(duì)各方法的適用條件進(jìn)行概述。對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法培養(yǎng)和檢出的細(xì)菌，可以利用基于16S rRNA序列的分子生物技術(shù)。16S rRNA基因分析技術(shù)是微生物多樣性究中最先使用的方法之一，在微生物的分類鑒定研究中發(fā)揮了重要的作用[22]。原核生物中的16S rRNA序列具有高度的保守性，在分子生物的角度看來(lái)，適用于分析屬及屬以上水平的菌株[27]。PCR-DGGE技術(shù)是根據(jù)PCR產(chǎn)物序列的特異性的熔解溫度來(lái)進(jìn)行分離的，只要條件合適且操作精確，可以檢測(cè)出具有一個(gè)核苷酸差異的DNA分子[13]。DGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。該方法可以同一時(shí)間檢測(cè)多個(gè)樣品以及區(qū)別群落中的處于優(yōu)勢(shì)的種類，對(duì)于了解種群時(shí)空變化是較好的方法，另外也可用來(lái)分析鑒定群落組成[27]?；?6S rRNA基因的DGGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于分析昆蟲腸道微生物多樣性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其具備定量精準(zhǔn)、簡(jiǎn)易高效、特異靈敏等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究的重要工具，目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、食品檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)與診斷等研究之中[39,62]。分子雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物群落組成研究中，有人曾采用16S rRNA基因探針芯片對(duì)水、土壤以及氣溶膠樣品中的微生物組成進(jìn)行了研究，檢測(cè)出的微生物種類明顯多于傳統(tǒng)的研究方法檢測(cè)到的微生物種類[63]。利用PCR-RFLP分析細(xì)菌16S rRNA基因，一般可將其鑒定到種及亞種的水平[34]。ARDRA技術(shù)主要作用于核糖體DNA序列，能較好反映種間多樣性，適合種級(jí)水平區(qū)分，己被廣泛地用于環(huán)境微生物多樣性、生物群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[42,64]。近年來(lái)，不斷發(fā)展起來(lái)的宏基因組測(cè)序技術(shù)，能夠解決實(shí)際工作中的許多問題。宏基因組是指某一生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，主要指細(xì)菌和真菌的基因組總和[48]。復(fù)雜生境中的可培養(yǎng)及不可培養(yǎng)微生物種類及基因信息都可通過(guò)該技術(shù)被了解[22]。分子生物學(xué)技術(shù)能夠更客觀的反應(yīng)微生物的種類，也更適合于對(duì)生殖道微生物種類和腸道微生物群落等復(fù)雜系統(tǒng)的種群結(jié)構(gòu)及多樣性的分析[6]。當(dāng)然也可通過(guò)結(jié)合多種方法進(jìn)行比較研究，從而更準(zhǔn)確地反映昆蟲微生物的多樣性[8,65]。目前常采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與分子生物學(xué)方法相結(jié)合的研究方式，來(lái)提高研究結(jié)果的可靠性。

由于測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)在的研究方法比較傾向于采用基因組測(cè)序，這樣能夠大大降低傳統(tǒng)培養(yǎng)和相關(guān)分子技術(shù)本身的一些缺陷，從而能更真實(shí)的反應(yīng)昆蟲和環(huán)境微生物的種類與數(shù)量[24]。在實(shí)際工作中，可根據(jù)檢測(cè)的材料、檢測(cè)的目標(biāo)和所擁有的基礎(chǔ)條件設(shè)施來(lái)選擇使用合適的研究方法。目前，利用宏基因組技術(shù)對(duì)昆蟲共生菌功能的研究報(bào)道還較少，因此，今后的研究方向可嘗試用宏基因組技術(shù)來(lái)分析昆蟲共生微生物的功能，完善昆蟲微生物的研究技術(shù)，為解釋昆蟲微生物與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫防御、抗藥性、生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)等方面的互作關(guān)系提供新思路。

附表1利用各分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The advantages and disadvantages of various molecular biology methods to identify the microorganisms