陽 剛,白 璐,殷中瓊*,魏 琴,杜永華,宋 旭,鄒元鋒,付羽萍,李 莉,田 野,陳書凡

1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川 宜賓 6440001

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611130

3.宜賓學(xué)院,四川 宜賓 644000

檸檬(Citrus limon)，又名檸果、益母果等，為蕓香科柑橘屬植物。具有殺菌、美容、提神、潤喉、降低膽固醇、預(yù)防壞血病、防止腎結(jié)石和心血管動脈硬化等功效，是一種營養(yǎng)和藥用價值極高的水果，因此被廣泛用于食品、化妝品等行業(yè)[1,2]。酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果等為原料，經(jīng)多種有益菌，如乳酸桿菌、酵母菌等發(fā)酵而成，含有豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[3]。由于其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗菌、消炎、凈化血液等多種保健功能[4-9]，而備受關(guān)注。隨著人們生活水平的不斷提高，人們對畜產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越高，尋找一種綠色安全飼料添加劑用來替代抗生素具有十分重要的意義。前人研究發(fā)現(xiàn)酵素能夠顯著提高小鼠及肉仔雞的免疫功能[10,11]。但目前國內(nèi)外關(guān)于酵素對鴨免疫功能的研究報道甚少。本試驗(yàn)從麻鴨血清中免疫球蛋白含量和細(xì)胞因子水平等常用的免疫學(xué)指標(biāo)來評估檸檬酵素的免疫增強(qiáng)活性，以期為檸檬酵素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

檸檬酵素和玉米粉，均由四川省宜賓市高縣沙河鎮(zhèn)檸檬基地提供。黃芪多糖粉（多糖寶），購于北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)。1日齡麻鴨，購于四川省宜賓市高縣本地。

1.2 試劑與儀器

Duck IgG ELISA KIT(LOT:201611)， Duck IgA ELISA KIT(LOT:201611)， Duck IgM ELISA KIT(LOT:201611)，Duck IL-2 ELISA KIT(LOT：201611)，Duck IFN-γELISA KIT(LOT:201611)，均由上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。全波長酶標(biāo)儀（型號:Varioskan Flash），由Thermo Scientific公司生產(chǎn)，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗(yàn)動物分組與飼養(yǎng)管理

選擇體重接近、體質(zhì)健康的1日齡麻鴨100只，隨機(jī)分為5組：空白對照組（玉米粉）、陽性對照組（玉米粉+0.5%黃芪多糖）、檸檬酵素I組（玉米粉+48%檸檬酵素）、檸檬酵素Ⅱ組（玉米粉+24%檸檬酵素）、檸檬酵素Ⅲ組（玉米粉+12%檸檬酵素），每組20只。預(yù)飼7 d，8日齡開始在試驗(yàn)組玉米粉中按不同濃度添加檸檬酵素，其余時間段均飼喂玉米粉，試驗(yàn)期為28 d。鴨舍為密閉式，采用單層籠上飼養(yǎng)，鴨只自由飲食、飲水。試驗(yàn)前按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，并且對鴨舍進(jìn)行嚴(yán)格的打掃和消毒。

1.4 血清中IgG、IgA、IgM含量的測定

分別于14、21和28日齡，每組隨機(jī)選取3只健康鴨，空腹從頸靜脈處用真空采血管采血。血樣在常溫下放置2 h后置4℃過夜，3500 rpm離心10 min，收集血清置于-20℃保存?zhèn)溆?。參照IgG、IgA、IgM ELISA試劑盒說明書的方法分別檢測血清中IgG、IgA、IgM的含量。

1.5 血清中IL-2和IFN-γ水平的測定

參照IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒說明書的方法分別檢測血清中IL-2與IFN-γ的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，采用軟件SPSS22.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酵素對麻鴨血清中IgG含量的影響

在玉米粉中添加檸檬酵素對麻鴨血清中IgG含量影響的測定結(jié)果見表1。

表1 檸檬酵素對麻鴨血清中IgG含量的影響Table 1 Effect of lemon enzyme on IgG content in the serum of hemp ducks

由表1可知，14日齡時，檸檬酵素組的IgG含量均高于空白對照組和陽性對照組，與空白對照組相比差異顯著(P＜0.05)，不同濃度檸檬酵素組之間比較差異不顯著(P＞0.05)，24%檸檬酵素組的IgG含量最高。21日齡時，檸檬酵素組的IgG含量均高于空白對照組和陽性對照組，顯著高于空白對照組(P＜0.05)，不同濃度檸檬酵素組之間比較差異不顯著(P＞0.05)，12%檸檬酵素組的IgG含量最高。28日齡時，各濃度檸檬酵素組的IgG含量與空白對照組和陽性對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，24%檸檬酵素組的IgG含量最高。隨著時間的推移，麻鴨血清中IgG含量呈升高趨勢。

2.2 檸檬酵素對麻鴨血清中IgA含量的影響

在玉米粉中添加檸檬酵素對麻鴨血清中IgA含量影響的測定結(jié)果見表2。

表2 檸檬酵素對麻鴨血清中IgA含量的影響Table 2 Effect of lemon enzyme on IgAcontent in the serum of hemp ducks

由表2可知，14日齡時，檸檬酵素組的IgA含量均高于空白對照組和陽性對照組，24%和12%檸檬酵素組IgA含量與空白對照組和陽性對照組相比差異顯著(P＜0.05)。21日齡時，檸檬酵素組的IgA含量均高于空白對照組，其中24%檸檬酵素組與空白對照組相比差異顯著(P＜0.05)，檸檬酵素組與陽性對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，不同濃度檸檬酵素組相比差異不顯著(P＞0.05)，24%檸檬酵素組的IgA含量最高。28日齡時，檸檬酵素組的IgA含量均高于空白對照組，24%檸檬酵素組與空白對照組相比差異顯著(P＜0.05)，檸檬酵素組與陽性對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。隨著時間的推移，麻鴨血清中IgA含量呈升高趨勢。

2.3 檸檬酵素對麻鴨血清中IgM含量的影響

在玉米粉中添加檸檬酵素對麻鴨血清中IgM含量影響的測定結(jié)果見表3。由表3可知，14日齡時，各組的IgM含量差異均不顯著(P＞0.05)，24%檸檬酵素組的IgM含量高于空白對照組和陽性對照組。21日齡時，各組的IgM含量差異均不顯著(P＞0.05)，24%檸檬酵素組IgM含量高于空白對照組。28日齡時，各組的IgM含量差異均不顯著(P＞0.05)，檸檬酵素組的IgM含量低于空白對照組和陽性對照組。

表3 檸檬酵素對麻鴨血清中IgM含量的影響Table 3 Effect of lemon enzyme on IgM content in the serum of hemp ducks

2.4 檸檬酵素對麻鴨血清中IL-2含量的影響

在玉米粉中添加檸檬酵素對麻鴨血清中IL-2含量影響的測定結(jié)果見表4。

表4 檸檬酵素對麻鴨血清中IL-2含量的影響Table 4 Effect of lemon enzyme on IL-2 content in the serum of hemp ducks

由表4可知，在整個試驗(yàn)期間，檸檬酵素添加組的血清IL-2含量均高于空白對照組。14日齡時，檸檬酵素添加組IL-2含量均高于空白對照組和陽性對照組，但升高不明顯(P＞0.05)，24%檸檬酵素組IL-2含量最高。21日齡時，檸檬酵素組IL-2含量均高于空白對照組和陽性對照組，24%檸檬酵素組IL-2含量最高，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。28日齡時，檸檬酵素組IL-2含量均高于空白對照組且差異顯著(P＜0.05)，與陽性對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，不同濃度檸檬酵素添加組之間比較差異亦不顯著，24%檸檬酵素組IL-2含量最高。

2.5 檸檬酵素對麻鴨血清中IFN-γ含量的影響

在玉米粉中添加檸檬酵素對麻鴨血清中IFN-γ含量影響的測定結(jié)果見表5。

表5 檸檬酵素對麻鴨血清中IFN-γ含量的影響Table 5 Effect of lemon enzyme on IFN-γ content in the serum of hemp ducks

由表5可知，14日齡時，檸檬酵素添加組IFN-γ含量均高于空白對照組和陽性對照組，但各組之間差異不顯著(P＞0.05)。21日齡時，檸檬酵素添加組IFN-γ含量均高于空白對照組，24%檸檬酵素組和12%檸檬酵素組IFN-γ含量高于陽性對照組，但各組之間差異不顯著(P＞0.05)。28日齡時，檸檬酵素添加組IFN-γ含量均高于空白對照組，但各組IFN-γ含量均在同一水平，差異不顯著(P＞0.05)。

3 討 論

免疫功能是指機(jī)體對疾病的抵抗力，機(jī)體的免疫功能是在免疫器官、免疫組織和免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他有關(guān)細(xì)胞及其產(chǎn)物的相互作用下完成的[12]。免疫系統(tǒng)由免疫組織、器官、免疫細(xì)胞及免疫活性分子等組成。免疫球蛋白是免疫活性分子中的一類，是與抗體分子相似的球蛋白，具有結(jié)合抗原、激活補(bǔ)體、結(jié)合細(xì)胞和調(diào)理作用等功能，其中IgG、IgA、IgM是家禽體內(nèi)三種重要的免疫球蛋白[13]。IgG是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%，主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒。IgA占血清免疫球蛋白含量的10～20%，血清型IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC作用。IgM約占血清免疫球蛋白總量的5%～10%，在補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞參與下，其殺菌、溶菌、激活補(bǔ)體促進(jìn)吞噬等作用均顯著高于IgG，對防止菌血癥發(fā)生具有重要作用。血清中免疫球蛋白濃度的高低在一定程度上反映了機(jī)體對疾病的抵抗能力。研究發(fā)現(xiàn)，以酵素飼喂仔豬可提高IgG、IgA、IgM含量，如黃愛霞[14]以和美酵素飼喂斷奶仔豬可提高血清中IgA、IgG和IgM的水平。董金格[15]用生物酵素飼喂肉仔雞，肉仔雞血清中IgG、IgA、IgM含量均高于空白對照組。胡新旭等人[16]以無抗發(fā)酵飼料替代部分基礎(chǔ)飼糧(不含抗生素)，斷奶仔豬血清IgG含量顯著高于對照組(P＜0.05)。張志焱[17]研究表明，在飲水中添加乳酸菌發(fā)酵上清液，可顯著提高22日齡肉仔雞血清中IgG的含量。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，檸檬酵素對IgM含量無明顯影響，但檸檬酵素可顯著提高14日齡和21日齡麻鴨血清中IgG含量，24%檸檬酵素在各時間點(diǎn)均可顯著提高麻鴨血清中IgA含量，此結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，表明麻鴨飼糧中添加檸檬酵素有助于提高其機(jī)體的免疫能力。

細(xì)胞因子是一類具有調(diào)節(jié)免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長以及損傷組織修復(fù)等多種功能的小分子蛋白質(zhì)。其中，IL-2是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，能有效地提高動物體免疫功能，它必須和受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[18]。IFN是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性[19]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，各濃度檸檬酵素均可顯著提高28日齡麻鴨血清中IL-2水平(P＜0.05)，并且可在一定程度上提高麻鴨血清中IFN-γ水平。這可能與檸檬酵素中含有的益生菌本身的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。謝俊華提出，植物乳桿菌NCU116發(fā)酵胡蘿卜漿對IL-2具有正調(diào)節(jié)作用[20]，并有報道稱不同乳酸菌介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的能力不同[21]。

檸檬酵素能夠提高動物的免疫力，其作用機(jī)理可能有以下3個方面：一是檸檬酵素中益生菌能促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育及免疫球蛋白含量的增多；二是益生菌可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌從而影響免疫應(yīng)答；三是檸檬自身的營養(yǎng)價值，益生菌及其產(chǎn)生的氨基酸、維生素、有機(jī)酸和醇類等物質(zhì)可能對麻鴨的血液循環(huán)，新陳代謝，造血機(jī)能，腸道菌群的改善有所幫助，并加強(qiáng)機(jī)體對疾病的抵抗能力從而達(dá)到增強(qiáng)免疫力的效果。

本試驗(yàn)研究初步證明，檸檬酵素具有免疫增強(qiáng)作用，但仍存在一些問題：如對檸檬酵素的發(fā)酵條件（溫度、CO2濃度、基質(zhì)濃度、pH、發(fā)酵時間等）與其作用的關(guān)系尚不清楚；不能確定檸檬酵素中有效成分及益生菌含量。另外，本次試驗(yàn)飼喂自制玉米粉，若將檸檬酵素作為飼料添加劑添加在市售飼料中能否在更大程度上發(fā)揮作用有待在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行更加深入、細(xì)致的研究。

4 結(jié) 論

玉米粉中添加檸檬酵素可顯著提高麻鴨血清中IgG和IgA含量，同時，玉米粉中添加檸檬酵素還可顯著提高麻鴨血清中IL-2水平。本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料檸檬酵素由宜賓高縣檸檬基地自主研發(fā)，將檸檬與發(fā)酵工藝相結(jié)合，成本低且操作簡便，是一種新型綠色飼料添加劑，為今后的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。