李高申，郭梅珍，牛美蘭，何雄文

(1. 黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，鄭州 450063； 2. 河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，鄭州 450006)

糖尿病患者發(fā)生糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcers，DFUs)的概率一生中高達25%，這些患者中有14%～24%的人群最終需要接受截肢治療[1]。目前糖尿病足的治療有溶栓、抗凝、擴血管、介入、血管搭橋、清創(chuàng)、截肢手術(shù)等，其治療療程較長、費用高且療效不理想，因此臨床急需尋求一種全新的治療方法或手段。近年來，干細胞移植治療下肢缺血病得到臨床認(rèn)可。干細胞可以在體內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，分泌促血管生成因子，逐漸分化并形成新生毛細血管，改善和恢復(fù)缺血下肢血流，達到治療下肢缺血的目的[2]。

本研究應(yīng)用自體骨髓血干細胞移植法治療糖尿病足潰瘍，觀察和評估干細胞移植后患者的肢體下肢血流圖及疼痛、皮膚溫度、靜息痛、跛行距離、踝肱指數(shù)和潰瘍愈合率的改善情況，并觀察聯(lián)合應(yīng)用活血生肌湯對糖尿病足相關(guān)指標(biāo)的變化，探索糖尿病足治療的有效方法和途徑。

1 資料

1.1 一般資料

表1顯示，選取2015年1月至2016年10月河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科收治糖尿病足潰瘍患者60例，在獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后(QXCRF2015-011)，每位受試者簽署知情同意書后實施。按照治療方式的不同分為常規(guī)內(nèi)科治療組(簡稱常規(guī)治療治)、常規(guī)內(nèi)科治療組+干細胞移植(簡稱干細胞移植組)、干細胞移植+常規(guī)內(nèi)科治療+活血生肌湯聯(lián)合治療組(簡稱活血生肌湯組)3組。3組受試者基礎(chǔ)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 各組患者基礎(chǔ)資料比較(±s，mmol/L)

表1 各組患者基礎(chǔ)資料比較(±s，mmol/L)

組別例數(shù)男/女年齡/歲病程/年糖化血紅蛋白(%)空腹血糖餐后2 h血糖P值常規(guī)治療組207∶862.20±4.575.86±2.998.15±1.408.19±1.0013.20±3.76>0.05干細胞移植組208∶763.71±5.446.07±2.418.22±1.197.34±2.5213.35±2.76>0.05活血生肌湯組208∶763.61±5.426.11±1.238.19±1.007.35±2.5313.29±2.76>0.05

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

糖尿病西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《糖尿病肢體動脈閉塞癥診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(草案)[3]，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布的《糖尿病中醫(yī)防治指南》[4]。

1.3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照《糖尿病肢體動脈閉塞癥診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(草案)；中醫(yī)辨證為“氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)”病證；下肢動脈血管造影(CT angiography，CTA)檢查有肢體動脈狹窄閉塞性改變，以腘及腘動脈以遠動脈病變?yōu)樽疃嘁?；年齡50～75歲；踝肱指數(shù)(ABI)≤0.4；潰瘍面積介于5～15 cm2。

排除標(biāo)準(zhǔn)：非2型糖尿病患者；50歲<年齡<75歲；不以膝下動脈病變?yōu)橹鞯奶悄虿∽慊颊?；踝肱指?shù)(ABI)>0.4；對方案中使用的藥物過敏者；合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；排除急性下肢動脈栓塞、多發(fā)性大動脈炎、血栓閉塞性脈管炎、雷諾氏病等其他缺血性疾病。

1.4 實驗所需藥物與器材

活血生肌湯組成：紅花8 g，丹參13 g，生黃芪8 g，乳香25 g，黨參17 g，川芎10 g，赤芍18 g，大黃8 g，黃柏5 g，生地黃8 g，由河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥制劑室制備(高壓濃縮煎煮為200 ml藥液)，分裝2袋，每袋100 ml；肝素、利多卡因、精蛋白生物合成人胰島素注射液等由醫(yī)院藥房提供。COM.TEC血細胞分離機(費森尤斯集團)；FACSCalibur流式細胞儀(上海碧迪醫(yī)療器械有限公司)；精密分析天平(上海第二天平儀器廠)；紅外線皮溫儀(意大利TECNIMED公司)；骨髓穿刺包(河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院)；多普勒血流探測儀及踝肱指數(shù)檢查套件(日本株式會社Hadeco公司)；C02恒溫孵育箱(德國Heracus公司)；BX41系統(tǒng)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；C1501DAB染色試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；超薄切片機(瑞士IMINA公司)；所有試劑(10%甲醛溶液、蘇木素、伊紅、25%戊二醛溶液、無水乙醇等)由河南省中醫(yī)藥研究院病理室提供。

2 方法

2.1 自體骨髓干細胞提取方法

依據(jù)常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備所需藥品、物品，手術(shù)中嚴(yán)格按照自體骨髓干細胞的分離、處理操作要求進行。

2.2 分組與治療實施

將60例糖尿病足伴有下肢慢性缺血的患者按隨機數(shù)字表法分為常規(guī)內(nèi)科治療組(常規(guī)治療組)20例共26條患肢，常規(guī)內(nèi)科治療組+干細胞移植(干細胞移植組)20例共29條患肢，干細胞移植+常規(guī)內(nèi)科治療+活血生肌湯聯(lián)合治療組(活血生肌湯組)20例共28條患肢，常規(guī)治療組患者從入院至隨訪結(jié)束統(tǒng)一行內(nèi)科常規(guī)治療：統(tǒng)一正規(guī)胰島素制劑調(diào)血糖、氨氯地平膠囊降壓、羅伐他丁降血脂、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗感染、阿司匹林抗凝等藥物治療，潰瘍局部行外科徹底清創(chuàng)換藥，局部壞死組織行手術(shù)切除；干細胞移植組患者在行同常規(guī)治療組內(nèi)科治療的同時，對于CTA檢查血管閉塞者行自體骨髓血干細胞移植治療；活血生肌湯組患者在常規(guī)內(nèi)科治療+自體的骨髓血干細胞移植的同時口服活血生肌湯100 ml/次，每日2次(10Am，8 pm)，2周為1個療程，連用3個療程。

2.3 療效評價指標(biāo)

2.3.1 主觀指標(biāo) 表2顯示，疼痛、冷感采用評分表法將其量化。

表2 糖尿病足臨床癥狀量化評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 潰瘍愈合情況 觀察潰瘍面積、潰瘍面愈合及潰瘍面愈合率比較 治療3個月后，觀察患者血壓、血糖、血脂、足趾皮溫、跛行距離、踝肱指數(shù)(ABI)的變化情況，查間歇跛行患者無痛步行時間(min)、下肢動脈造影、實驗室指標(biāo)檢測、病理學(xué)檢測等。

2.4 效果評價

痊愈：創(chuàng)面完全愈合，臨床癥狀消失；顯效：肉芽上皮生長，創(chuàng)面面積縮小75%，臨床癥狀有改善；好轉(zhuǎn)：肉芽上皮生長，創(chuàng)面面積縮小25%，臨床癥狀稍有改善；無效：肉芽上皮無明顯生長或肉芽晦暗，創(chuàng)面面積縮小不足25%，臨床癥狀無改善。愈合率=完全愈合例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，用L-SD，S-N-K進行檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3組治療3個月后療效比較

表3顯示，與常規(guī)治療組比較，干細胞移植組和活血生肌湯組患者移植后的指標(biāo)(血糖、靜息疼、足冷感覺、間歇跛行、足趾皮溫、踝肱指數(shù))差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與干細胞移植組比較，活血生肌湯組患足間歇性跛行、足趾皮溫、踝肱指數(shù)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 糖尿病足患者治療3個月后各項指標(biāo)結(jié)果比較(±s, mmol/L)

表3 糖尿病足患者治療3個月后各項指標(biāo)結(jié)果比較(±s, mmol/L)

組別例數(shù) 糖化血紅蛋白(%)空腹血糖餐后2 h血糖靜息疼足冷感覺間歇間跛行足趾皮溫踝肱指數(shù)P值常規(guī)治療組207.42±1.616.95±1.6411.23±2.242.43±0.822.99±0.452.99±0.8531.88±1.190.41±0.24干細胞移植組 207.38±1.236.86±2.1210.10±1.281.38±0.73★ 2.22±0.79★2.22±0.79★32.99±1.33★ 0.55±0.33★<0.05活血生肌湯組 207.07±0.976.12±1.329.19±1.021.16±0.39 ★△ 1.44±0.64★△1.44±0.64 ★△33.66±1.46 ★△0.58±0.49★△<0.05

注：治療3個月后與常規(guī)治療組比較：★P<0.05，與干細胞移植組、活血生肌湯組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與干細胞移植組：△P<0.05與活血生肌湯組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

3.2 3組治療3個月后血壓、血脂比較

表4顯示，與常規(guī)治療組比較，干細胞移植組、活血生肌湯組血壓、TC、TG、LDL-C、HDL-C降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HDL-C較常規(guī)治療組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；活血生肌湯組TC、TG、LDL-C較常規(guī)治療組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，活血生肌湯組HDL-C較常規(guī)治療組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 治療3月后3組血脂比較(±s， mmHg， mmol/L)

表4 治療3月后3組血脂比較(±s， mmHg， mmol/L)

組別例數(shù)收縮壓舒張壓TCTGLDL-CHDL-CP值常規(guī)治療組20135.27±17.1276.60±6.804.76±0.972.15±2.112.76±0.701.12±0.25干細胞移植組20136.25±22.32★72.32±16.74★4.63±0.92★1.95±1.83★2.71±0.81★1.17±0.39★<0.05活血生肌湯組20132.23±32.3471.21±12.304.56±1.33★★1.69±1.24★★2.71±0.63★★1.32±0.30★★<0.01

注：治療3個月后與常規(guī)治療組比較：★P<0.05,★★P<0.01，干細胞移植組、活血生肌湯組血壓、TC、TG、LDL-C、 HDL-C比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義， 活血生肌湯組TC、TG、LDL-C、 HDL-C差異有統(tǒng)計學(xué)意義

3.3 治療3個月后潰瘍面積及愈合率、創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量比較

表5顯示，3組治療前對潰瘍面積及愈合率、創(chuàng)面肉芽組織中的毛細血管數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療3個月后，活血生肌湯組創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量明顯多于常規(guī)治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；活血生肌湯組多于干細胞移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 3組左側(cè)患足潰瘍面積/創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量、愈合率比較 (±s，cm2)

表5 3組左側(cè)患足潰瘍面積/創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量、愈合率比較 (±s，cm2)

組別例數(shù)治療前潰瘍面/毛細血管數(shù)量治療3個月后潰瘍面/毛細血管數(shù)量愈合率(%)P值常規(guī)治療組2016.4±7.6/ 6.66±0.5216.35±2.51/11.7±0.250/20(0.00)>0.05干細胞移植組2017.0±7.5/ 6.85±0.601.45±1.86★/ 15.3±0.6613/20(65.00)★<0.05活血生肌湯組2017.5±7.8/ 6.75±0.560.22±0.68★★ / 22.0±0.6319/20(96.43)★★<0.01

注：治療3個月后與常規(guī)治療組比較:★P<0.05,★★P<0.01(干細胞移植組、活血生肌湯組的潰瘍面/創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量、愈合率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，活血生肌湯組的潰瘍面/創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量、愈合率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義)；與干細胞移植組比較：△P<0.05(活血生肌湯組差異有統(tǒng)計學(xué)意義)

3.4 治療3個月后選擇3組血管顯影典型病例比較

圖1顯示，常規(guī)治療組治療3個月后左膝下脛后動脈阻塞，干細胞移植組治療3個月后左脛后動脈暢通，活血生肌湯組治療3個月后血流直達左足部。

3.5 實驗室指標(biāo)

表6、7顯示，患者治療3個月前后左下肢腘動脈管徑、足背動脈管徑及血流速度、左下肢正中、腓神經(jīng)傳導(dǎo)速度進行比較。

圖1 治療3個月后常規(guī)治療組、干細胞移植組、活血生肌湯組血管造影比較

組別例數(shù)治療前/后腘動脈管徑 治療前/后腘動脈流速治療前/后足背動脈管徑治療前/后足背動脈流速P值常規(guī)治療組200.45±0.12/0.49±0.1346.25±5.32/48.96±4.260.24±0.02/0.27±0.0430.34±4.53/33.45±4.21>0.05干細胞移植組200.45±0.23/0.55±0.2246.42±4.42/62.43±4.210.24±0.02/0.40±0.1332.34±4.51/36.03±4.51<0.05活血生肌湯組200.44±0.22/0.96±0.2346.32±4.32/62.93±4.210.24±0.01/0.91±0.2332.24±4.41/36.03±4.51<0.05

表7 3組治療前后左下肢神經(jīng)傳導(dǎo)速度變化比較(±s，mm/s)

表7 3組治療前后左下肢神經(jīng)傳導(dǎo)速度變化比較(±s，mm/s)

組別例數(shù)治療前/后正中神經(jīng)傳導(dǎo)速度 治療前/后腓神經(jīng)傳導(dǎo)速度P值常規(guī)治療組2045.43±1.26/45.67±1.7136.21±1.02/37.56±1.21>0.05干細胞移植組2044.45±1.01/56.36±1.2136.17±0.33/46.31±0.63<0.05活血生肌湯組2044.55±1.11/44.55±1.1136.27±0.43/47.81±0.73<0.05

注：常規(guī)治療組2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干細胞移植組、活血生肌湯組2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干細胞移植組、活血生肌湯組治療后的效果優(yōu)于常規(guī)治療組(P<0.05)，活血生肌湯組優(yōu)于干細胞移植組(P<0.05)

3.6 組織病理學(xué)觀察

圖2、3顯示，3組創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量比較，治療前3組創(chuàng)面肉芽組織中的毛細血管數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療3個月后，與常規(guī)治療組比較，活血生肌湯組創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與干細胞移植組比較，活血生肌湯組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組治療前創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察(HE×200)注：3組創(chuàng)面肉芽組織中的毛細血管數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05

圖3 各組治療3月后創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察(HE×200)注：活血生肌湯組創(chuàng)面肉芽組織中毛細血管數(shù)量較常規(guī)治療組明顯增多，P<0.01；但較干細胞移植組毛細血管數(shù)量增多，P<0.05

3.7 安全指標(biāo)評價

活血生肌湯組1例患者輕微惡心、嘔吐、腹痛，停用口服中藥1周內(nèi)癥狀消失；其余組干細胞移植治療后精神、飲食、情緒、血、尿常規(guī)、心電圖、肝腎功能、外周血象均無異常。

4 討論

近年來，干細胞移植技術(shù)逐漸用于治療下肢缺血，移植到缺血處的干細胞逐漸分化并形成新生的毛細血管，可改善和恢復(fù)下肢血液循環(huán)，達到治療因糖尿病引起慢性下肢缺血的目的[5-6]。本次研究發(fā)現(xiàn)，自體骨髓干細胞移植組(活血生肌湯組、活血生肌湯組)治療3個月后腘動脈管徑、足背動脈管徑較移植前寬，腘動脈及足背動脈血流速度較移植前快，正中神經(jīng)、腓神經(jīng)傳導(dǎo)速度較移植前快，且干細胞移植組、活血生肌湯組治療后下肢血流及神經(jīng)傳導(dǎo)速度的效果均優(yōu)于常規(guī)治療組，且干細胞移植組、活血生肌湯組患者干細胞移植治療3個月后，左脛后動脈及左下肢動脈直達足底。本研究結(jié)果證實，自體骨髓干細胞移植治療糖尿病足下肢缺血效果是很明顯的。

干細胞移植之所以治療下肢缺血有效，是因為自體骨髓干細胞移植可以分化成血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，直接形成新的血管；通過旁分泌形式生成多種血管生成因子，促進血管新生[7-9]；大量的動物實驗表明，骨髓干細胞移植能促使缺血的后肢生成新生血管。2002年Tateishi Yuyama等首次應(yīng)用自體骨髓干細胞移植治療缺血性下肢血管病，取得了滿意的療效，且未發(fā)生明顯的不良反應(yīng)[10-12]。本次研究發(fā)現(xiàn)，干細胞移植組、活血生肌湯組干細胞移植治療3個月后新生毛細血管數(shù)較常規(guī)治療組多，且無不良反應(yīng)。該研究結(jié)果與資料是一致的，證實了自體骨髓干細胞移植后糖尿病足潰瘍新生血管的形成。

中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病足是由于“氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)”阻于四肢脈絡(luò)，氣血不能供養(yǎng)肌肉筋骨引起患肢的麻木疼痛或肢端壞疽。課題組認(rèn)為，陰虛內(nèi)熱是糖尿病發(fā)病的根本，而瘀血內(nèi)停為糖尿病足病因，瘀血內(nèi)停、脈絡(luò)血瘀滯流、閉塞不通導(dǎo)致下肢缺血壞死。本研究是在活血生肌湯具有改善糖尿病足下肢循環(huán)作用[13]的基礎(chǔ)上，在自體骨髓干細胞移植的同時合用活血生肌湯治療糖尿病足。

活血生肌湯方中的紅花、丹參、赤芍具有活血化瘀、改善糖尿病下肢微循環(huán)、促進病變組織的修復(fù)與再生，協(xié)同黨參、生黃芪、生地黃補氣、養(yǎng)血生津、止血祛瘀生肌的作用，加之乳香、川芎的活血行氣、解郁、通達、止痛之功效及黃柏的攻積滯、清濕熱等均可治療糖尿病足潰瘍。本次研究結(jié)果不論從一般指標(biāo)還是客觀指標(biāo)(血管顯影、動脈管徑、血流速度、神經(jīng)傳導(dǎo)、毛細血管數(shù)量等)變化情況均證實，活血生肌湯具有活血通絡(luò)、祛瘀生肌、促進干細胞移植后血管新生、建立側(cè)枝循環(huán)的作用，研究結(jié)果為糖尿病足的治療提供了理論依據(jù)和方法。

本研究顯示，自體骨髓干細胞移植技術(shù)治療糖尿病足是有效的，活血生肌湯可以提高自體骨髓血干細胞移植技術(shù)的療效。