韓振興，王韞沛，張碩、3，孔祥洪，王力

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306； 2.國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 信息學(xué)院，上海 201306)

魚類等生物體在生存過程中可能遇到各種環(huán)境(如重金屬、溫度、磁場等)的變化，而內(nèi)外環(huán)境的變化在一定程度上會引起溶菌酶(LZM)、血液蛋白、堿性磷酸酶(AKP)和乙酰膽堿酯酶(AChE)等生物血清生化指標(biāo)的變化。AKP參與體內(nèi)的消化、運輸?shù)裙δ?，是生物體中非常重要的解毒體系[1]，而一定的環(huán)境脅迫會導(dǎo)致AKP活性下降。高舉等[2]和詹付鳳等[3]發(fā)現(xiàn)，鉛離子和鎘離子均對鯽CarassiusauratusAKP活性有抑制作用。高權(quán)新等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高溫會導(dǎo)致銀鯧幼魚AKP活性下降。AChE不僅是細(xì)胞發(fā)育及成熟的重要參與者，還參與神經(jīng)功能調(diào)節(jié)和肌肉運動等重要功能，但某些環(huán)境脅迫會抑制其活性。一定濃度的草甘膦污染液對鯽AChE均起抑制作用[5]。LZM能夠破壞致病菌的細(xì)胞壁，使得致病菌死亡，起到抗菌、抗病毒等作用，但其活性同樣會受到某些環(huán)境變化的影響,其中，溫度上升一定程度上會促使史氏鱘Acipenserschrencki血清和組織中LZM的含量升高[6]。血液蛋白是由肝臟合成而來，其含量和質(zhì)量的變化在一定程度上能反映出機(jī)體肝臟等器官是否正常，但這種變化會受到環(huán)境變化的影響，研究表明，經(jīng)磁處理水飼養(yǎng)的鯽血清蛋白譜帶與對照組有明顯差異[7]。

從目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，通過檢測生化指標(biāo)變化研究環(huán)境脅迫對生物體影響的報道眾多，但研究電磁場對生物生理影響的報道較少，且大多以白鼠等陸生生物為研究對象。如一定強(qiáng)度的電磁輻射會降低大鼠的血紅蛋白[8]；脈沖電磁場會導(dǎo)致大鼠體內(nèi)多項指標(biāo)異常，細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞增多，從而引起機(jī)體損傷[9]。關(guān)于電磁場對魚類的影響，目前僅有少量研究報道，如袁健美等[10]就不同強(qiáng)度電磁場對12種海洋生物存活率與行為影響進(jìn)行了研究；劉憲亭等[11]就磁處理水對羅非魚Oreochromismossambica生長的影響進(jìn)行了研究；汝碧瀟[12]就電磁場(ELF)對羅非魚的生物學(xué)效應(yīng)存在“窗”特性進(jìn)行了研究；Formicki等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鱒的仔魚與幼魚的行為改變會受到磁場的影響；Juutilainen[14]研究發(fā)現(xiàn)，ELF對哺乳動物生長發(fā)育無明顯影響，但會促進(jìn)其骨骼發(fā)育。另有研究表明，添加脈沖磁場作用時，大鼠心電幅值增大若干倍，且該幅值隨著電流的增大而增大[15]；ELF對小鼠記憶能力的影響也具有“窗效應(yīng)”[16]。迄今為止，有關(guān)電磁場對魚類生理影響的研究鮮有報道，而隨著水域風(fēng)電場的大規(guī)模建設(shè)，電磁場對水生生物生理、行為等的影響也越來越受到人們的關(guān)注。為此，本研究中以鯽為研究對象，外加電磁場脅迫，選取血清溶菌酶(LZM)、蛋白、堿性磷酸酶(AKP)和乙酰膽堿酯酶(AChE)等作為反映電磁場對鯽幼魚影響的主要生化指標(biāo)，通過魚類行生理試驗方法，研究了不同磁場強(qiáng)度環(huán)境對鯽幼魚的影響，探討了電磁場輻射時間及電磁場強(qiáng)度與各生化指標(biāo)變化間的關(guān)系，以期為電磁場生物學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鯽幼魚和飼料來自上海南匯地區(qū)東海魚類養(yǎng)殖基地。選擇健康生長狀況良好的鯽40尾，雌雄兼有，體長為(13±0.5)cm，體質(zhì)量為(103±2)g，放于實驗室水槽內(nèi)暫養(yǎng)(無電磁場輻射)。

玻璃水箱規(guī)格為50 cm×50 cm×50 cm，水箱材質(zhì)為透明亞克力板，試驗前用黑色塑料板將水箱包裹，以減少光照對試驗的影響。試驗全程除更換試驗用水和血液采集外無其他人為活動干擾。血液采集使用1 mL一次性無菌注射器。其他試驗用品包括2 mL無菌離心管、37 ℃水浴鍋、離心機(jī)、紫外可見分光光度計(UV-1700)、樣品低溫保存冰柜(DW-40W255)、鹽度計(IC20-III)、便攜式pH計(SG2-ELK)和壓力蒸汽滅菌器(XFS-280A)。

測量鯽幼魚生化指標(biāo)的試劑盒主要有：堿性磷酸酶(AKP)測試盒(緩沖液、基質(zhì)液、顯色劑等)，乙酰膽堿酯酶(AChE)測試盒(標(biāo)準(zhǔn)品、底物緩沖液、顯色劑、抑制劑、透明劑等)，溶菌酶檢測試劑盒(菌粉、菌粉溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品等)，蛋白定量測試盒等，上述4種試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，指標(biāo)具體檢測原理與方法見說明書。血液抗凝劑為檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)。

1.2 方法

1.2.1 試驗裝置及試驗魚飼養(yǎng)管理 試驗在玻璃水箱中進(jìn)行。根據(jù)亥姆霍茲線圈電磁場分布特點，將試驗魚缸放置在亥姆霍茲線圈中軸線處，魚缸整體處于距中心三分之二半徑范圍內(nèi)的均勻磁場區(qū)域，線圈可外接電源產(chǎn)生磁場。試驗用魚放置在水缸中，配備24 h充氧裝置(圖1)。水缸和底座采用亞克力材料，不影響磁場正常發(fā)生。

圖1 電磁場對鯽幼魚影響試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of a test device in the effects of electromagnetic field on juvenile crucian carp experiment

試驗用養(yǎng)殖水為經(jīng)過48 h曝氣處理的自來水，養(yǎng)殖過程中實行24 h增氧，溶解氧保持在(10.93±0.1)mg/L。每天定時(12：00)向每個缸內(nèi)投放約6 g顆粒狀飼料，每天換水1/4，水溫為(10±1)℃，pH約為7.0。試驗用魚在暴露磁場試驗前先暫養(yǎng)一周，以避免試驗用魚在采集和運輸過程中因劇烈運動或環(huán)境改變而引起血液指標(biāo)變化。

1.2.2 試驗設(shè)計 試驗中將鯽幼魚隨機(jī)分為5組，每組8尾。以相同數(shù)量不接受電磁場輻射試驗魚作為空白對照組，其余4個試驗組魚全天候不間斷分別暴露在0.5、1.0、1.5、2.0 mT的恒定磁場環(huán)境中，除電磁場輻射外，其他試驗條件與暫養(yǎng)時保持相同。血液采集時間固定于上午11：00，每48 h從魚尾動脈采血1次，每次對所有試驗魚均采集血液樣本1.5 mL，共采集5次，試驗時間共持續(xù)10 d。血液樣本采集后，立即以3000 r/min離心3 min，取上清液并保存于冰箱(4 ℃)中以備用。試驗結(jié)束后，按照相同方法另取樣本進(jìn)行重復(fù)試驗。試驗數(shù)據(jù)取兩次試驗的平均值，并利用F檢驗進(jìn)行幾組樣本間與對照組間的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同電磁場環(huán)境下鯽血清堿性磷酸酶活性的變化

從表1可見：對照組魚血清AKP活性在試驗階段基本保持在穩(wěn)定水平(29.8～30.5 U/L)，各電磁場試驗組魚血清的AKP活性隨著磁場暴露時間的延長均出現(xiàn)不同程度的降低；從試驗第2天開始至試驗結(jié)束，各電磁場試驗組魚AKP活性均顯著低于對照組(P<0.05)；在0～4 d內(nèi)AKP活性降幅較大，4～8 d內(nèi)AKP活性降幅有所減緩，8～10 d內(nèi)AKP活性趨于平穩(wěn)；試驗結(jié)束時，鯽血清中AKP活性降至初始狀態(tài)的63%～65%。

從表1還可見，在不同磁場強(qiáng)度下，與初始值相比，從第2天開始各電磁場組魚AKP活性變化存在顯著性差異(P<0.05)。其中，2 mT試驗組較其他試驗組AKP活性下降幅度最大，活性最低，各電磁場試驗組魚AKP活性變化幅度為A2.0 mT>A1.5 mT>A1.0 mT>A0.5 mT。各試驗組最終AKP活性為U2.0 mT

表1 電磁場對鯽幼魚血清堿性磷酸酶活性的影響Tab.1 Effects of electromagnetic field on alkaline phosphatase activity in serum of juvenile crucian carp U/L

注：同行中標(biāo)有不同小寫字母者表示組內(nèi)有顯著性差異(P<0.05)；同列中標(biāo)有不同大寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)；標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同

Note:The means with different letters within the same line are significant differences in the same group at the 0.05 probability level；The means with different capital letters within the same column are significantly different among the group at the 0.05 probability level；The means with the same letters within the same line are not significant differences, et sequentia

2.2 不同電磁場環(huán)境下鯽血清蛋白含量的變化

從表2可見：對照組魚血清總蛋白含量在試驗階段基本保持在穩(wěn)定水平(37.67～39.12 g/L)，各電磁場試驗組魚血清蛋白含量隨著磁場暴露時間的延長均出現(xiàn)不同程度的降低；與對照組相比，第2天時，1.5、2.0 mT試驗組血清蛋白含量下降明顯(P<0.05)，而1.0、0.5 mT試驗組血清蛋白含量下降不明顯(P>0.05)；第4～10 天時，各試驗組血清蛋白含量均呈明顯下降(P<0.05)，在0～6 d內(nèi)，各電磁場試驗組魚血清蛋白含量降低幅度較大，由平均39.13 g/L降至29.50 g/L，降低了24.61%；試驗結(jié)束時，各電磁場試驗組血清蛋白含量是初始狀態(tài)的68.26%～74.90%。

從表2還可見，對于不同磁場下的各試驗組在相同暴露時間內(nèi)，電磁場強(qiáng)度較大的試驗組魚血清總蛋白含量較低，且在暴露初期下降程度大于電磁場強(qiáng)度較小的試驗組，但在后期基本都處于穩(wěn)定。其中，1.5 mT和2.0 mT強(qiáng)度電磁場對血清蛋白含量均有明顯的抑制作用，且抑制程度明顯高于1.0 mT和0.5 mT強(qiáng)度，尤其是2.0 mT試驗組在第2～8天時顯著低于0.5、1.0 mT組(P<0.05)，但1.5 mT和2.0 mT兩組間蛋白含量變化程度相近(P>0.05)。各試驗組對血清蛋白含量抑制變化幅度為U2.0 mT≈U1.5 mT>U1.0 mT>U0.5 mT。各試驗組最終血清蛋白含量為G2.0 mT

第8天后電磁場強(qiáng)度較大試驗組蛋白含量較低，可能是因為較強(qiáng)的電磁場對魚類肝臟等細(xì)胞的破壞性更大，導(dǎo)致蛋白合成效率降低，無法及時補充血液中消耗的總蛋白量。

表2 電磁場對鯽幼魚血清蛋白含量的影響Tab.2 Effects of electromagnetic field on protein content in serum of juvenile crucian carp g/L

2.3 不同電磁場環(huán)境下鯽血清乙酰膽堿酯酶活性的變化

從表3可見：對照組魚血清AChE活性在試驗階段略有增加，但基本保持在穩(wěn)定水平(2.62～2.80 U/mL)，各電磁場試驗組魚體內(nèi)的AChE活性隨著磁場暴露時間的延長先增強(qiáng)后減弱，最終低于原始活性；各電磁場試驗組酶活性在第2天時出現(xiàn)較明顯的增強(qiáng)趨勢，但與對照組相比，0.5、1.5、2.0 mT試驗組AChE活性變化幅度顯著增大(P<0.05)；各電磁場試驗組AChE活性在第4～10天時逐漸減弱，并最終下降至初始酶活性的85.98%～95.47%，對照組上升至初始酶活性的106.49%。

從表3還可見,對于不同磁場強(qiáng)度下的試驗組在相同暴露時間內(nèi)，電磁場強(qiáng)度較大的試驗組魚血清AChE活性波動較大，且在暴露中期下降程度大于電磁場強(qiáng)度較小的試驗組，但在后期基本都處于穩(wěn)定。在第2天時，2.0 mT和1.5 mT試驗組間AChE活性增強(qiáng)程度較大，明顯高于1.0 mT和0.5 mT試驗組(P<0.05)；在第8～10 天時，2.0 mT試驗組AChE活性下降程度明顯高于其他試驗組(P<0.05)。試驗過程中，各電磁場試驗組AChE活性變化幅度為A2.0 mT>A1.5 mT>A1.0 mT>A0.5 mT。各電磁場試驗組最終AChE活性依次為U0.5 mT>U1.5 mT>U1.0 mT>U2.0 mT。

表3 電磁場對鯽幼魚血清乙酰膽堿酯酶活性的影響Tab.3 Effects of electromagnetic field on acetylcholine esterase activity in serum of juvenile crucian carp U/mL

2.4 不同電磁場環(huán)境下鯽血清溶菌酶活性的變化

從表4可見：對照組魚血清LZM活性在試驗階段基本保持在穩(wěn)定水平(198.53～205.75 U/mL)，各電磁組試驗組魚血清LZM活性隨磁場暴露時間的延長呈先增強(qiáng)后減弱趨勢，最終低于原始活性。其中，在0～4 d內(nèi)，LZM活性出現(xiàn)增強(qiáng)，在2 mT電磁場環(huán)境中酶活性最強(qiáng)，達(dá)到了253.09 U/mL；4～10 d時，LZM活性穩(wěn)步下降，在第10 天時達(dá)到最低水平(178.98～198.83 U/mL)。在第2～6 天時，各電磁場試驗組魚LZM活性明顯高于對照組(P<0.05)；在第8天時，1.0 mT試驗組LZM活性仍然顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組LZM活性均下降至對照組水平(P>0.05)，在第10天時，1.5、2.0 mT試驗組LZM活性顯著低于對照組(P<0.05)，其他試驗組LZM活性略低于對照組(P>0.05)。

從表4還可見,在第2天時各試驗組之間LZM活性變化存在差異性(P<0.05)，第4 天時2.0 mT試驗組LZM活性明顯高于其他試驗組(P<0.05)，第6～8天時，1.0 mT試驗組LZM活性高于其他試驗組(P<0.05)，第10天時，2.0 mT試驗組LZM活性明顯低于其他試驗組(P<0.05)。因此，不同強(qiáng)度電磁場輻射對鯽血清LZM活性影響程度不同。試驗過程中，各電磁場試驗組LZM活性變化幅度為A2.0 mT>A1.5 mT>A1.0 mT>A0.5 mT，各電磁場試驗組最終LZM活性依次為U0.5 mT≈U1.0 mT>U1.5 mT>U2.0 mT。

表4 電磁場對鯽幼魚血清溶菌酶活性的影響Tab.4 Effects of electromagnetic field on lysozyme activity in serum of juvenile crucian carp U/mL

3 討論

魚類本身生存的環(huán)境為自然電磁環(huán)境，電磁強(qiáng)度較弱，而人為制造的電磁環(huán)境為強(qiáng)電磁環(huán)境。因此，外加0.5～2.0 mT強(qiáng)度的電磁場必然引起鯽原有生存環(huán)境的變化，而這種電磁脅迫可能會一定程度上引起鯽體內(nèi)生化指標(biāo)變化。

3.1 電磁場對鯽血清堿性磷酸酶活性的影響

從本試驗結(jié)果可以看出，外界電磁場環(huán)境的變化也會引起魚類體內(nèi)AKP活性的變化，主要表現(xiàn)為抑制作用。AKP活性在試驗前期下降較快，這可能是由于外界電磁環(huán)境急性變化引起的。高權(quán)新等[4]認(rèn)為，急性溫度脅迫能夠顯著影響銀鯧幼魚的正常代謝，并在一定程度上改變其體內(nèi)AKP活性，其中高溫處理使得魚體內(nèi)AKP活性下降。而本研究結(jié)果顯示，磁場脅迫也會引起鯽幼魚血清AKP的變化，在磁場強(qiáng)度為2 mT的情況下，鯽幼魚體內(nèi)AKP活性下降幅度最大，且AKP活性下趨勢與磁場強(qiáng)度增強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)，而隨著時間的延長，AKP活性變化趨于平穩(wěn)。

高舉等[2]研究認(rèn)為，鉛離子能夠?qū)a不同器官及組織的AKP產(chǎn)生差異性影響，對鯽腸、鰓組織中的AKP活性起到了抑制作用。詹付鳳等[3]研究發(fā)現(xiàn)，鎘對鯽不同器官及組織的AKP影響也存在差異。周洋等[17]研究發(fā)現(xiàn)，150 mT的恒定磁場(CMF)能夠促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞的增殖與功能，而200 mT的CMF對小鼠成骨細(xì)胞的增殖及功能有抑制作用。李玥等[18]研究發(fā)現(xiàn)，30、100、200 μT的極低頻磁場(ELE-MF)對日本長耳大白兔體質(zhì)量、血常規(guī)和肝腎功能無影響。因此，內(nèi)外界環(huán)境的變化可能會引起包括魚類在內(nèi)的生物體體內(nèi)生化指標(biāo)和器官的變化。

3.2 電磁場對鯽血清蛋白含量的影響

從本試驗結(jié)果可知，電磁脅迫引起了鯽血清蛋白含量的變化，主要表現(xiàn)為抑制作用。血清蛋白含量在試驗前期(0～6 d)下降較快，這可能是由于外界電磁環(huán)境急性變化引起的。而隨著時間的延長，血清蛋白含量變化趨于平穩(wěn)，這可能是體內(nèi)蛋白含量達(dá)到最低狀態(tài)而無法繼續(xù)下降，或者是電磁場抑制了某些與蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)的酶的活性。曾仕廉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，用磁處理水飼養(yǎng)的鯽血清蛋白譜帶與對照組有明顯差異，血清蛋白譜帶平均變化率為32.5%，磁處理水對鯽的最佳影響時期為10 d左右。這與本研究中鯽幼魚血清蛋白含量在試驗組與對照組間的變化差異及試驗組隨試驗時間產(chǎn)生變化的研究結(jié)果相一致。

3.3 電磁場對鯽血清乙酰膽堿酯酶活性的影響

楊煜榮等[19]通過對小白鼠外加3100 Gs電磁場研究發(fā)現(xiàn)，電磁場能增加正常小白鼠血清膽堿酯酶活性，而Barnothy[20]也發(fā)現(xiàn)了此規(guī)律。林建原等[21]在磁場對AChE活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，磁化時間為120 min、磁場強(qiáng)度為150 mT時，AChE活力增加24.0%，如果作用時間達(dá) 15 h, AChE的活性基本喪失。所以，不同強(qiáng)度的電磁場對不同生物的AChE影響也不同。而本研究結(jié)果顯示，在第0～2天內(nèi)，鯽幼魚血清AChE活性出現(xiàn)增強(qiáng)，甚至在2.0 mT電磁場環(huán)境中酶活性最強(qiáng)，達(dá)到了2.92 U/mL。初步分析認(rèn)為，電磁場對魚體的刺激引起魚體神經(jīng)系統(tǒng)分泌過多乙酰膽堿，為了水解過多乙酰膽堿，保持魚體系統(tǒng)穩(wěn)定，從而分泌較多的AChE。第2～8天時酶活性的降低速度較快，這可能是由于較長時間暴露，引起細(xì)胞壞死或蛋白質(zhì)分子構(gòu)象異常所導(dǎo)致[22]，具體原因有待進(jìn)一步研究；第8～10天時AChE活性趨于穩(wěn)定并處在較低水平，此時已有少量試驗魚出現(xiàn)萎靡不振甚至死亡現(xiàn)象。

本試驗中，電磁場強(qiáng)度較大試驗組魚血清AChE酶活性波動也較大，可能是因為較強(qiáng)的電磁場對魚類細(xì)胞通透性或神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞影響較大，其造成的瞬間刺激作用也較為明顯，極易容易引起魚體不適，導(dǎo)致魚體做出應(yīng)激反應(yīng)。

3.4 電磁場對鯽血清溶菌酶活性的影響

從本試驗結(jié)果可知，在相同暴露時間內(nèi)，電磁場強(qiáng)度較大的試驗組魚血清LZM酶活性波動較大，且在暴露中期下降程度大于電磁場強(qiáng)度較小的試驗組。電磁場強(qiáng)度較大試驗組LZM酶活性波動大，可能是因為較強(qiáng)的電磁場對魚類的瞬間刺激作用較為明顯，體內(nèi)壞死細(xì)胞等較多，魚體為分解壞死細(xì)胞等分泌大量LZM，后因長期輻射，引起免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致LZM活性降低。

王文博等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖鯽會使其血清中LZM活性受到抑制，影響其健康。鄧平平等[24]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度對長江刀鯽的非特異性免疫酶活性有一定影響。王煒軍等[25]在其研究中發(fā)現(xiàn)，LZM本身具有一定磁性，其活性會受到磁的影響。因此，在外加電磁場脅迫時，LZM活性發(fā)生一定程度的變化。結(jié)合本研究初步判斷，一定強(qiáng)度的電磁場脅迫會抑制鯽血清LZM活性。

4 結(jié)論

電磁場對鯽血清4種生化指標(biāo)的影響基本為抑制作用，說明多數(shù)外界環(huán)境的變化對魚體本身會造成不利影響。而電磁場對這些酶或蛋白質(zhì)的影響機(jī)制目前還不確定，可能是通過直接作用試驗對象本身而產(chǎn)生應(yīng)激性，進(jìn)而影響其功能，也有可能對構(gòu)成這些物質(zhì)的蛋白質(zhì)等分子產(chǎn)生影響。但通過本研究發(fā)現(xiàn)，電磁場對血清蛋白含量有減少的作用。因此，一系列酶活性的降低極有可能是由血清蛋白含量減少造成的。酶活性的降低和蛋白含量的減少說明磁場對其需要長時間影響才能產(chǎn)生。