吳光亮，劉新濤，胡 冰，孫 怡，曾曉雄*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

茶作為一種消費量高的飲品，在世界范圍內(nèi)廣受人們的喜愛。按照茶葉發(fā)酵程度的不同，茶葉可分為3 種類型：綠茶（未發(fā)酵茶）、烏龍茶（半發(fā)酵茶）和紅茶（全發(fā)酵茶）[1]。紅茶在世界茶葉產(chǎn)量和消費量等方面占據(jù)主導(dǎo)地位，研究表明紅茶具有抗腫瘤[2]、預(yù)防心腦血管疾病[3-4]、預(yù)防糖尿病[5]、抗肥胖[6-7]、抗病毒[8]、抗炎癥[9]和抗氧化[10-11]等生理功能，這些生理功能和紅茶中茶黃素類物質(zhì)密切相關(guān)[12-13]。

茶黃素類物質(zhì)是在紅茶生產(chǎn)過程中兒茶素類物質(zhì)在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）作用下成對氧化形成的一類二聚體[14]，它在紅茶中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2%，是與紅茶感官品質(zhì)和功能性密切相關(guān)的主要成分[15-16]。茶黃素類物質(zhì)主要由4 種茶黃素單體（圖1）組成，它們分別為茶黃素（theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-O-gallate，TF2A）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（theaflavin-3’-O-gallate，TF2B）、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（theaflavin-3,3’-O-digallate，TFDG）[17]，TFDG為紅茶中主要的茶黃素。TFDG是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallatocatechin gallate，EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）的氧化產(chǎn)物[18]，但是它在紅茶中含量很低，蔡海蘭等[19]分析了9 個產(chǎn)區(qū)紅茶的茶黃素含量，TFDG平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%，最低為0.21%，最高為0.54%，這為深入研究和利用TFDG帶來了困難，大規(guī)模制備高純度的單體是現(xiàn)階段亟待解決的問題。

圖1 茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of theaf l avins

獲取茶黃素粗品的方法主要有直接提取法、化學(xué)合成法和酶促合成法。酶促合成法指利用PPO在通氧的條件下催化兒茶素合成茶黃素的方法，酶促合成法效率高、安全性好。不同來源的PPO之間活性差異較大，其中梨PPO合成茶黃素的能力較高[20]，是理想的PPO來源。茶黃素的分離純化方法主要有柱層析法[21]、制備型高效液相色譜法和制備型高速逆流色譜（high speed countercurrent chromatography，HSCCC）法[22-23]。為大規(guī)模制備TFDG單體，本研究利用單因素試驗和響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化TFDG合成底物EGCG/ECG物質(zhì)的量比、pH值和溫度等反應(yīng)條件，并利用AB-8層析柱結(jié)合HSCCC從酶促反應(yīng)液中純化TFDG單體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皇冠梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Huangguan）南京市蘇果超市；EGCG、ECG 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；不溶性聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pynrolidone，P V P P） 北京市索萊寶生物科技有限公司；乙腈、乙酸乙酯（色譜級） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；5C18-AR-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱 日本Cosmosil公司；BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化公司；LyoQuest-55真空冷凍干燥機 西班牙Telstar公司；CJJ78-1磁力加熱攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 PPO粗酶液的制備

參考李健等[24]方法并稍作修改。稱取100 g去皮后的皇冠梨切成碎塊，加入適量PVPP、VC和預(yù)冷的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 5.6）100 mL，搗碎，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液。往上清液中緩慢均勻加入硫酸銨粉末，制成70%硫酸銨飽和度的溶液，粗酶液制備操作在冰浴中進(jìn)行，所得溶液4 ℃冰箱中過夜，10 000 r/min離心10 min，沉淀以適量pH 5.6檸檬酸-磷酸鹽緩沖液溶解，即為PPO粗酶液。

1.3.2 PPO催化兒茶素合成TFDG的條件優(yōu)化

按一定的EGCG/ECG物質(zhì)的量比稱取EGCG和ECG，加入到50 mL一定pH值的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中，使得ECG終濃度為10 mmol/L，加入1 mL PPO，于一定溫度120 r/min磁力攪拌下進(jìn)行酶促反應(yīng)，HPLC分析反應(yīng)液中各個組分含量。TFDG產(chǎn)率計算見下式：

式中：a為TFDG合成的物質(zhì)的量；b為加入的ECG物質(zhì)的量。

1.3.2.1 單因素試驗

選擇EGCG/ECG物質(zhì)的量比、pH值和溫度3 個單因素分別進(jìn)行單因素試驗。固定pH 4.5、反應(yīng)溫度30 ℃，探究EGCG/ECG物質(zhì)的量比（1∶1、3∶1、4.5∶1、6∶1、9∶1）對TFDG產(chǎn)率的影響。固定EGCG/ECG物質(zhì)的量比3∶1、反應(yīng)溫度30 ℃，探究pH值（3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對TFDG產(chǎn)率的影響。固定EGCG/ECG物質(zhì)的量比3∶1、pH 4.5，探究溫度（15、25、35、45、55 ℃）對TFDG產(chǎn)率的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗

利用單因素試驗確定的水平范圍，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗并確定PPO催化合成TFDG的最佳試驗條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素及水平Table1 Level and code of factors used for Box-Behnken design

1.3.3 HPLC分析

方法1：參考薛金金[25]方法，HPLC分析采用Agilent液相色譜儀，色譜柱：5C18-AR-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：280 nm；流動相：A：50 mmol/L磷酸；B：乙腈；流速：0.7 mL/min；梯度洗脫程序：0～39 min，96%～70% A相；39～54 min，70%～25% A相。

在方法1基礎(chǔ)上稍作修改得方法2：H P L C分析采用Agilent液相色譜儀，色譜柱：5C18-AR-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：280 nm；流動相：A：50 mmol/L磷酸；B：乙腈-乙酸乙酯（7∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；洗脫程序：0～25 min，82%～68% A相。

1.3.4 TFDG單體的純化

以最優(yōu)EGCG/ECG物質(zhì)的量比、pH值及溫度條件下酶法合成TFDG，反應(yīng)60 min后置于沸水浴5 min滅酶以終止酶促反應(yīng)，隨后將反應(yīng)液上樣于AB-8層析柱，先用1 個柱體積（BV）的水洗脫層析柱，除去反應(yīng)液中的蛋白等雜質(zhì)，再用2 BV的90%乙醇溶液洗脫層析柱，收集乙醇洗脫液并濃縮凍干，得TFDG粗品。

參照江和源等[26]方法利用HSCCC從TFDG粗品中純化TFDG單體。配制水-乙酸乙酯-正己烷-甲醇（6∶3∶1∶1，V/V）的兩相溶劑體系，將其充分混合后，靜置分層，上相作為固定相，下相作為流動相；稱取適量的TFDG粗提物，加入15 mL上相溶解并上樣于HSCCC儀，轉(zhuǎn)速：800 r/min，流速：2.0 mL/min，檢測波長：280 nm，溫度：25 ℃，流出液部分收集器收集利用HPLC檢測，將TFDG組分合并濃縮凍干，即為TFDG單體。

2 結(jié)果與分析

2.1 生成TFDG的HPLC檢測結(jié)果

圖2 黃冠梨PPO合成TFDG的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of reaction mixtures during TFDG synthesis mediated by PPO from Huangguan pear

如圖2所示，梨PPO可以催化EGCG和ECG合成TFDG，經(jīng)過60 min的反應(yīng)，大部分EGCG和ECG轉(zhuǎn)化為TFDG，這說明梨PPO具有較好的合成TFDG能力。因此，本研究以TFDG產(chǎn)率高低作為評價標(biāo)準(zhǔn)，探討PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的最適EGCG/ECG物質(zhì)的量比、pH值和反應(yīng)溫度。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 EGCG/ECG物質(zhì)的量比對合成TFDG的影響

圖3 EGCG/ECG物質(zhì)的量比對梨PPO合成TFDG的影響Fig.3 Effect of EGCG/ECG molar ratio on the synthesis of TFDG

TFDG的生成過程為EGCG和ECG生成相應(yīng)的醌和；相應(yīng)的醌再等量結(jié)合生成TFDG。據(jù)文獻(xiàn)[27]報道，反應(yīng)體系中EGCG可能會被酶氧化所消耗，使得EGCG產(chǎn)生的醌不足以和ECG產(chǎn)生的醌相結(jié)合；且EGCG容易被ECG產(chǎn)生的醌氧化，導(dǎo)致EGCG的量進(jìn)一步減少，因此需提高反應(yīng)體系中EGCG/ECG物質(zhì)的量比。由圖3可知，以EGCG和ECG作為底物合成TFDG時，EGCG和ECG的物質(zhì)的量比對TFDG產(chǎn)率影響較大。EGCG/ECG物質(zhì)的量比為1∶1時，EGCG產(chǎn)生的醌不足以和ECG產(chǎn)生的醌相結(jié)合，TFDG的產(chǎn)率為54.1%；但是EGCG/ECG物質(zhì)的量比為3∶1時，EGCG產(chǎn)生的醌足以和ECG產(chǎn)生的醌相結(jié)合，TFDG的產(chǎn)率可大幅度提高到77.3%，隨著底物物質(zhì)的量比例的升高，TFDG的產(chǎn)率并未明顯提高。為節(jié)約兒茶素同時保證TFDG產(chǎn)率，設(shè)定EGCG/ECG物質(zhì)的量比為3∶1作為響應(yīng)面試驗的中心點。

2.2.2 反應(yīng)pH值對合成TFDG的影響

圖4 反應(yīng)pH值對梨PPO合成TFDG的影響Fig.4 Effect of reaction pH on the synthesis of TFDG

TFDG在堿性條件下不穩(wěn)定，且PPO活性受pH值影響較大，可見反應(yīng)pH值對于TFDG產(chǎn)率有著重要影響。由圖4可知，當(dāng)pH值為3.0時，酶活力在該pH值條件下比較低，導(dǎo)致TFDG的產(chǎn)率僅為22.7%；pH值在4.0～5.5范圍時，TFDG產(chǎn)率為80%～87%；當(dāng)pH值升高到6.0～7.0時，TFDG產(chǎn)率急劇下降至35.5%，推測pH值升高使得PPO活力下降，且TFDG在堿性條件下不穩(wěn)定。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH 4.0作為響應(yīng)面試驗的中心點。

2.2.3 反應(yīng)溫度對合成TFDG的影響

圖5 反應(yīng)溫度對梨PPO合成TFDG的影響Fig.5 Effect of reaction temperatures on the synthesis of TFDG

溫度對酶促反應(yīng)的影響表現(xiàn)在2 個方面：一方面是溫度升高，酶促反應(yīng)速度加快；另外一方面溫度升高，酶的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致酶活性降低甚至失去。從圖5可以看出，溫度升高到35 ℃，TFDG的產(chǎn)率隨著溫度的升高而增加，在35 ℃左右TFDG產(chǎn)率達(dá)到峰值，隨后開始下降。由此，選擇35 ℃作為響應(yīng)面試驗的中心點。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

通過響應(yīng)面法對EGCG/ECG物質(zhì)的量比（X1）、pH值（X2）和反應(yīng)溫度（X3）3 個因素的優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 多元回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the quadratic polynomial model

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知，p H值和溫度對T F D G得率的影響極顯著（P＜0.01）。以TFDG得率作為響應(yīng)值，經(jīng)過擬合后得回歸方程：TFGD產(chǎn)率=84.26+0.44X1+2.20X2+1.39X3-0.25X1X2+0.78X1X3-1.55X2X3-3.19X12-4.82X22-2.89X32。

回歸模型的F值較高（6 7.4 6），P值較低（＜0.000 1），說明模型極顯著。該模型的決定系數(shù)R2值為0.986 4，表明TFDG產(chǎn)率的實驗值和預(yù)測值間的一致性良好；調(diào)整系數(shù)值為0.968 9，說明TFDG產(chǎn)率總變異中的96.89%由獨立變量決定，所研究的因素中只有3.11%不能被此回歸模型解釋。此外還可得出獨立變量對TFDG產(chǎn)率的影響次序為pH值＞反應(yīng)溫度＞EGCG/ECG物質(zhì)的量比。

由圖6可以直觀地看出，各因素交互作用對TFDG產(chǎn)率的影響，若曲線越陡峭，表明各因素對得率的影響越大[28]；2D圖形狀可以說明因素間的交互作用顯著與否，若等高線是圓形，說明交互作用不顯著，若為橢圓，則顯著[29]。pH值和反應(yīng)溫度對TFDG產(chǎn)率的影響作用較大，兩者交互作用顯著，這與表3結(jié)果吻合。

圖6 多元回歸模型響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the quadratic polynomial model

通過軟件分析確定PPO催化合成TFDG的最佳條件為EGCG/ECG物質(zhì)的量比為3.08∶1、pH 4.10、溫度36.96℃，在此條件下計算得出的TFDG產(chǎn)率理論值為84.63%。為方便實驗進(jìn)行選取EGCG/ECG物質(zhì)的量比3.1∶1、pH 4.10、溫度37 ℃進(jìn)行驗證實驗，得到TFDG產(chǎn)率為（85.14±0.40）%，實驗值與預(yù)測值一致性較好。說明該多元二次回歸方程可靠性較好，適合對TFDG產(chǎn)率的預(yù)測。

2.4 TFDG單體的純化結(jié)果

大孔吸附樹脂多用于黃酮類、生物堿類和苷類等成分的分離純化，具有吸附量大、選擇性好、再生簡單和成本低等優(yōu)點。郁軍等[30]研究了NKA-9、AB-8和ADS-73 種不同極性的大孔吸附純化茶黃素的工藝條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADS-7的純化效果最差，NKA-9較AB-8有更高的解吸率，但是兩者差別不大。本實驗使用AB-8樹脂對酶法合成的TFDG進(jìn)行純化，以除去反應(yīng)液中的蛋白等雜質(zhì)。同時，HSCCC是無載體的分離，所以不存在載體的吸附，樣品利用率高，HSCCC最大的優(yōu)點在于進(jìn)樣量大，因而在生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物及食品領(lǐng)域被廣泛利用。本研究先用AB-8樹脂對酶促反應(yīng)反應(yīng)液進(jìn)行純化得到TFDG粗品，再利用HSCCC純化粗中的TFDG單體。

圖7 HSCCC純化TFDG粗提物色譜圖（A）、TFDG單體的HPLC圖（B）Fig.7 HSCCC chromatogram of crude TFDG (A) and HPLC of monomeric TFDG (B)

圖7A為HSCCC純化TFDG的色譜圖，經(jīng)HPLC分析2號和3號峰分別為EGCG和ECG，4號峰為TFDG（圖7B），TFDG的純度可達(dá)到97%，說明該方法能夠高效地從TFDG的粗提物中純化出高純度的TFDG單體。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗探討了物質(zhì)的量比（EGCG/ECG）、pH值和反應(yīng)溫度對皇冠梨PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的影響，利用Box-Behnken試驗優(yōu)化得出最佳底物物質(zhì)的量比（EGCG/ECG）3.1∶1、pH 4.1、反應(yīng)溫度37 ℃；利用AB-8層析柱結(jié)合HSCCC對最優(yōu)反應(yīng)條件下合成的TFDG反應(yīng)液進(jìn)行純化，TFDG產(chǎn)率和純度分別能達(dá)到85.14%和97%；實驗表明該方法對TF1、TF2A和TF2B的制備同樣適用，因此本研究為高效率制備各茶黃素單體提供了參考依據(jù)。