KANG Suyoung，朱 蔭，鄭新強(qiáng)，梁月榮,*，林 智,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2.浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江 杭州 310058）

茶葉香氣是影響茶葉品質(zhì)好壞和消費(fèi)者選擇的重要因素之一。茶葉香氣的形成主要受茶樹(shù)品種、栽培環(huán)境、采摘季節(jié)、加工工藝等因素影響，促使茶葉香氣物質(zhì)的組成和含量存在差異，從而產(chǎn)生不同類型的香氣品質(zhì)[1-2]。根據(jù)生產(chǎn)季節(jié)的不同，茶葉有春茶、夏茶和秋茶之分，不同季節(jié)的茶葉香氣品質(zhì)受氣候條件如光照、溫濕度、光質(zhì)、雨量等影響，制成的茶葉香氣有所區(qū)別。一般而言，春茶香氣最高，秋茶次之，夏茶香氣最低[3]。張正竹等[4]研究表明春、秋季的香氣前體總量高于夏季，香氣前體種類則隨季節(jié)變化的消長(zhǎng)規(guī)律也存在明顯差異。賴幸菲等[5]將不同季節(jié)翠玉品種加工的綠茶香氣進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，春茶和夏茶的香氣物質(zhì)種類較多，物質(zhì)組成較為相似，且春茶主導(dǎo)香氣成分多呈現(xiàn)為花香型；秋茶的香氣物質(zhì)種類較少，主導(dǎo)香氣成分與春、夏兩季不同。由此可見(jiàn)，生產(chǎn)季節(jié)對(duì)茶葉香氣品質(zhì)的形成起著至關(guān)重要的作用，查明不同季節(jié)間茶葉的關(guān)鍵差異性香氣成分有助于進(jìn)一步豐富茶葉香氣化學(xué)理論，更可為綠茶香氣的形成機(jī)理研究及科學(xué)評(píng)價(jià)提供理論參考依據(jù)。

本研究旨在查明不同季節(jié)綠茶樣品間的關(guān)鍵差異性成分，因此在茶樹(shù)的產(chǎn)區(qū)及品種選取上需具有較強(qiáng)的廣泛性及針對(duì)性。中國(guó)茶葉主要分布在西南、華南、江南及江北4 個(gè)產(chǎn)區(qū)，其中西南產(chǎn)區(qū)是中國(guó)最古老的茶區(qū)，而江南產(chǎn)區(qū)為中國(guó)茶葉主要產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量大約占全國(guó)茶葉總產(chǎn)量的2/3，產(chǎn)區(qū)內(nèi)茶葉具有較強(qiáng)的代表性[6]。兩大產(chǎn)區(qū)的四季均較為分明，受茶樹(shù)生長(zhǎng)的氣候、濕度、水分及溫度等生態(tài)因素影響大，其成品茶在揮發(fā)物質(zhì)組成上也會(huì)表現(xiàn)出顯著性差異。因此在本研究中擬采用來(lái)自重慶永川、貴州銅仁（西南產(chǎn)區(qū)）及安徽安慶（江南產(chǎn)區(qū)）的代表性茶樹(shù)品種（碧香早、福鼎大白茶、迎霜、皖茶91和舒茶早）作為研究對(duì)象。在品種選擇上，所選取的茶樹(shù)品種具有較強(qiáng)代表性及地域特色，如福鼎大白茶、迎霜為國(guó)家級(jí)無(wú)性系茶樹(shù)品種，由于抗逆性強(qiáng)，耐旱耐寒，因此被廣泛種植于多個(gè)產(chǎn)區(qū)；而皖茶91和舒茶早則是安徽地區(qū)較為知名的兩個(gè)國(guó)家級(jí)茶樹(shù)品種，具有較強(qiáng)的地域特點(diǎn)及代表性[7]。

另一方面，頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）法是利用萃取纖維的選擇性吸附特性對(duì)所需檢測(cè)成分進(jìn)行微量萃取的一種方法，可用于收集干茶和茶湯的揮發(fā)性化合物[8-9]。HS-SPME的優(yōu)點(diǎn)在于集采樣、萃取、濃縮為一體，與氣相或液相色譜等儀器聯(lián)用能簡(jiǎn)便、快捷地分析樣品，而無(wú)需有機(jī)溶劑、成本低[10-11]。因此，該方法在近年來(lái)被廣泛運(yùn)用于茶葉的香氣成分定性定量分析上[12-13]。偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminate analysis，PLS-DA）在茶葉種類判別及品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面已有較好的應(yīng)用[14-16]。葉能勝等[17]采用膠束電動(dòng)色譜熒光誘導(dǎo)法結(jié)合PLS-DA技術(shù)將3 種不同綠茶正確區(qū)分。本課題組曾采用HS-SPME/氣相色譜-火焰離子檢測(cè)器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）及HS-SPME結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)茶葉中常見(jiàn)的12 種揮發(fā)性萜類化合物的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分析[18-20]，結(jié)合PLS-DA技術(shù)將大葉種及小葉種紅茶區(qū)分，并采用該技術(shù)使綠茶、白茶及黑茶分別獲得良好的聚類效果[21]。本研究選取了四季較為分明的西南及江南產(chǎn)區(qū)的知名茶樹(shù)品種作為樣本來(lái)源，采用HSSPME法結(jié)合GC-MS分析不同茶樹(shù)品種加工而成的不同季節(jié)綠茶樣品的香氣成分，繼而利用PLS-DA技術(shù)對(duì)不同季節(jié)綠茶香氣成分進(jìn)行判別分析，從而對(duì)不同季節(jié)綠茶間的關(guān)鍵差異性香氣成分進(jìn)行進(jìn)一步的聚類分析，旨在查明不同季節(jié)綠茶香氣形成差異的主要貢獻(xiàn)成分，并探索不同季節(jié)綠茶香氣成分組成及含量的分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

為了使分析結(jié)果更具有代表性及參考意義，本研究選用來(lái)自3 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的茶樹(shù)鮮葉品種，分別為重慶永川的“碧香早（BXZ）”和“福鼎大白茶（YCFD）”、貴州銅仁的“迎霜（T RY S）”和“福鼎大白茶（TRFD）”以及安徽安慶的“皖茶91（WC）”和“舒茶早（SCZ）”。分別于2014年春季（4月20—30日）、夏季（7月21—30日）及秋季（9月12—20日）采用相同的加工工藝制備相應(yīng)綠茶樣品1～2 個(gè)批次，共計(jì)32 個(gè)樣品，其中春季茶樣12 個(gè)：銅仁福鼎的2 批次茶樣、銅仁迎霜的2 批次茶樣、皖茶91的2 批次茶樣、舒茶早的2 批次茶樣、碧香早的2 批次茶樣及永川福鼎的2 批次茶樣；夏季茶樣10 個(gè)：銅仁福鼎的2 批次茶樣、銅仁迎霜的1 個(gè)茶樣、皖茶91的2 批次茶樣、舒茶早的1 個(gè)茶樣、碧香早的2 批次茶樣及永川福鼎的2 批次茶樣；秋季茶樣10 個(gè)：銅仁福鼎的1 個(gè)茶樣、銅仁迎霜的2 批次茶樣、皖茶91的2 批次茶樣、舒茶早的2 批次茶樣、碧香早的2 批次茶樣及永川福鼎的1 個(gè)茶樣。

無(wú)水乙醚（色譜級(jí)） 美國(guó)Tedia公司；正己烷（色譜級(jí)） 德國(guó)Meker公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)；氯化鈉（分析級(jí)）、愈創(chuàng)木酚（色譜級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯環(huán)己烷（色譜級(jí)） 日本TCI公司；癸酸乙酯（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGX-9243B-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AB265-S電子天平 梅特勒-托利多（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；QP2010 Ultra GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；5 0/3 0 μ m二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷共聚物（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）SPME萃取頭、SAAB-57330U SPME手柄 美國(guó)色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品加工

鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一為一芽二葉，采用傳統(tǒng)炒青加工工藝制備綠茶，加工步驟如下：鮮葉經(jīng)過(guò)攤晾5 h→230 ℃滾筒殺青5 min→揉捻20 min→120 ℃毛火干燥15 min→攤晾1 h→90 ℃足火干燥（含水量＜5%），備用。

1.3.2 樣品前處理

統(tǒng)計(jì)測(cè)得的巖石標(biāo)本密度數(shù)據(jù)（如表1 冀北地區(qū)中生代巖漿巖部分密度數(shù)據(jù)），得知處于地表的火山巖包括火山碎屑巖、火山熔巖，一些亞類的巖石，如粗面巖、流紋巖、英安巖等，平均密度不足2.50×103kg/m3。但玄武巖、安山巖具有較高的密度，超過(guò)2.55×103kg/m3。潛火山巖、深成巖共同構(gòu)成侵入地表的巖漿巖。潛火山巖、花崗巖、正長(zhǎng)巖的亞類巖石密度菌未達(dá)到2.60×103kg/m3。但輝長(zhǎng)巖、斜長(zhǎng)巖、閃長(zhǎng)巖的密度均高于2.60×103kg/m3，有的甚至超過(guò)2.70×103kg/m3，由此不難得出冀北地區(qū)中生代巖漿巖中一些偏酸性的巖石亞類密度較偏基性的巖石亞類密度低。

本研究采用HS-SPME法提取揮發(fā)性化合物，萃取步驟如下：茶水比為1∶50（g/mL），即稱取3 g茶樣加熱水150 mL（100 ℃），在70 ℃水浴提取10 min后，通過(guò)4 層棉布過(guò)濾除去茶渣。取10 mL過(guò)濾后的茶湯至20 mL玻璃瓶中，加內(nèi)標(biāo)（0.002 mg/L的氯環(huán)己烷5 μL，25 mg/L的愈創(chuàng)木酚5 μL，0.5 mg/L的癸酸乙酯5 μL）和經(jīng)過(guò)120 ℃烘干機(jī)烘干1 h以上的氯化鈉2 g。蓋上聚四氟乙烯瓶蓋均勻振蕩后，往玻璃瓶中插入含DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）萃取纖維的手動(dòng)SPME裝置，在40 ℃恒溫水浴吸附60 min。取出后立即插入GC-MS進(jìn)樣口中解吸附3.5 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS條件

G C條件：進(jìn)樣口溫度25 0 ℃，色譜柱為HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦（純度為99.999%），柱流量為1 mL/min；升溫程序?yàn)?0 ℃保持10 min，以3 ℃/min的速率升到150 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度180 ℃，電子能量-70 eV，掃描質(zhì)量范圍35～400 u，掃描模式為全離子掃描。

1.3.4 綠茶香氣成分的定性定量

安捷倫數(shù)據(jù)工作站中NIST2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比對(duì)，篩選匹配度達(dá)到90%以上的化合物，同時(shí)結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)分析，排除雜質(zhì)或柱流失等干擾性化合物。采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)最終確定的香氣化合物進(jìn)行相對(duì)定量，采用待測(cè)組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積（總和）的比值作為相應(yīng)化合物的相對(duì)含量。每個(gè)茶樣重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Excel 2010（美國(guó)Microsoft公司）進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算及數(shù)據(jù)分析；PLS-DA采用SIMCA-P 11.5軟件（瑞典Umetrics公司）完成；Mann-Whitney檢驗(yàn)采用SPSS Statistics 20.0（美國(guó)IBM公司）分析；關(guān)鍵香氣成分在綠茶不同季節(jié)中的分布規(guī)律使用MeV生物信息學(xué)分析軟件（美國(guó)Oracle公司）中的層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）來(lái)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)綠茶香氣成分的組成及含量

圖1 綠茶揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in green tea

表1 不同季節(jié)綠茶樣品（TRYS、TRFD及WC品種）中鑒定出的揮發(fā)性化合物及其相對(duì)含量Table1 The identif i ed volatile components and their relative contents in green tea (TRYS, TRFD and WC cultivars) harvested in different seasons

表2 不同季節(jié)綠茶樣品（SCZ、BXZ及YCFD品種）中鑒定出的香氣化合物及其相對(duì)含量Table2 The identif i ed volatile components and their relative contents in green tea (SCZ, BXZ and YCFD cultivars) harvested in different seasons

定量分析結(jié)果表明，雖然3 個(gè)季節(jié)綠茶的香氣成分的種類基本相同，但在含量比例上有著較為顯著的差異。如圖2所示，在3 個(gè)季節(jié)中，醇類化合物均占有最高比例，介于49%～54%之間，其中秋季綠茶中醇類含量最高；醛類化合物在3 個(gè)季節(jié)綠茶中的含量均僅次于醇類，相對(duì)含量介于18%～32%之間，其中夏季綠茶中該類化合物含量最高；其他類化合物的含量最低，在3 個(gè)季節(jié)中相對(duì)含量均低于3%。

圖2 春（A）、夏（B）、秋（C）季綠茶的揮發(fā)性化合物的分布比較Fig.2 Comparison in distribution prof i les of volatile compounds among green teas harvested in spring (A), summer (B) and autumn (C)

春季綠茶中香葉醇的含量最高（平均相對(duì)含量為10.13%），芳樟醇及順茉莉酮的相對(duì)含量次之（平均相對(duì)含量分別為9.11%和7.16%）；夏季綠茶中，芳樟醇與（反,反）-2,4-庚二烯醛占有最高比例（平均相對(duì)含量分別為14.35%和13.15%）；秋茶中芳樟醇的相對(duì)含量最高（平均相對(duì)含量為10.06%），脫氫芳樟醇及（反,反）-2,4-庚二烯醛含量次之（平均相對(duì)含量分別為7.07%和6.31%）。香葉醇、芳樟醇及脫氫芳樟醇均屬于萜烯醇類化合物，這類物質(zhì)普遍具有怡人的香氣和較低的香氣閾值，沸點(diǎn)相對(duì)較高，對(duì)綠茶香氣的形成有重要作用[22]。香葉醇是茶葉中含量較高的香氣物質(zhì)之一，在春茶中的含量最高，而夏季中降至最低，它被認(rèn)為是茶葉花香來(lái)源的關(guān)鍵化合物[23]；芳樟醇具有百合或玉蘭花香氣，它本身大量存在于茶樹(shù)鮮葉中，也來(lái)源于加工過(guò)程中葡萄糖苷的水解，因此在成品茶中有極高的含量，同樣也被認(rèn)為是茶葉花香的重要來(lái)源[22]。

2.2 不同季節(jié)綠茶香氣成分的判別分析

由于茶葉香氣成分繁多復(fù)雜，且受茶樹(shù)品種、產(chǎn)區(qū)、季節(jié)及加工因素等多方面影響，很難通過(guò)簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)分析獲得有效的變量。多元統(tǒng)計(jì)分析手段能夠在多個(gè)對(duì)象和多個(gè)指標(biāo)互相關(guān)聯(lián)的情況下分析目標(biāo)樣品的統(tǒng)計(jì)規(guī)律，因此被廣泛運(yùn)用于茶葉科學(xué)領(lǐng)域。其中主成分分析（principal component analysis，PCA）是常見(jiàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段，在烏龍茶[24]、白茶[25]及蘭香型茶葉[26]的判別分析上有廣泛的應(yīng)用。本研究基于不同季節(jié)綠茶香氣成分的相對(duì)含量建立了相應(yīng)的PCA模型，如圖3a所示，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，綠茶樣品無(wú)法以季節(jié)為指定變量獲得較好聚類效果。推測(cè)由于PCA采用無(wú)監(jiān)督的降維分析方法，樣品中品種及產(chǎn)地等因素對(duì)該模型的干擾較大，所以無(wú)法獲得理想效果。PLS-DA是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，其原理是對(duì)不同處理樣本（如觀測(cè)樣本、對(duì)照樣本）的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并檢驗(yàn)訓(xùn)練集的可信度。該方法可以預(yù)先對(duì)所需的觀察變量進(jìn)行分組，后根據(jù)組別性質(zhì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而可以精確獲悉影響分組的關(guān)鍵變量[15]。本研究采用SIMCA-P 11.5軟件對(duì)香氣檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，基于不同季節(jié)綠茶香氣成分的相對(duì)含量建立了相應(yīng)的PLS-DA模型。如圖3b所示，通過(guò)該P(yáng)LS-DA模型可成功區(qū)分春、夏、秋三季的綠茶樣品，且良好的擬合參數(shù)（R2Y=0.903，Q2=0.570）證明了該模型的準(zhǔn)確性。由于當(dāng)變量數(shù)量大于樣品數(shù)量時(shí)，使用有監(jiān)督判別方法進(jìn)行分析時(shí)易產(chǎn)生過(guò)擬合現(xiàn)象，因此需要使用置換檢驗(yàn)方法考察PLS-DA在無(wú)差異情況下的建模效果[27]。如圖3c所示，經(jīng)過(guò)200 次交叉驗(yàn)證之后，Q2回歸直線與Y軸的截距均小于0，表明該P(yáng)LS-DA判別模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，模型較為可靠。

PLS-DA變量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)，VIP值越大，變量在不同季節(jié)間差異越顯著，當(dāng)VIP值大于1時(shí)，可界定對(duì)應(yīng)的變量為該判別模型的關(guān)鍵變量[15]。如表3所示，本研究已建立的PLS-DA模型中，VIP值大于1的化合物共有16 種，它們分別是順-茉莉酮、苯甲醇、3,5-辛二烯-2-酮、反-2-辛烯醛、β-環(huán)檸檬醛、1-己醇、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、（反,反）-2,4-庚二烯醛、壬醛、脫氫芳樟醇、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、1-壬醇、3-甲基呋喃、1-庚醇、2-甲基呋喃及1-乙基-1-吡咯-2-甲醛，以上化合物被鑒定為不同季節(jié)綠茶間的關(guān)鍵差異性香氣成分；其中，順-茉莉酮的VIP值最高（1.72），其含量在不同季節(jié)綠茶間的差異極大，在春茶中的平均相對(duì)含量（7.16%）高于夏茶（0.64%），應(yīng)該為受季節(jié)因素影響最大的香氣化合物。此外，這16 種化合物的香氣特征各不相同，主要表現(xiàn)為花果香、青草香、甜香及烘烤香型等（表3）[28]，推測(cè)它們?cè)诓煌竟?jié)綠茶中迥異的含量分布對(duì)相應(yīng)綠茶的香氣品質(zhì)形成有著重要的影響。

圖3 不同季節(jié)綠茶香氣成分PLS-DA得分圖及其驗(yàn)證模型Fig.3 Score plot and PLS-DA model of volatile components in green teas grown in different seasons

為了使分析結(jié)果更為精確，采用Kruskal-Wallis及Mann-Whitney檢驗(yàn)[29]對(duì)VIP值大于1的化合物進(jìn)行進(jìn)一步分析。如表3所示，16 種VIP值大于1的化合物中，大部分化合物的P值小于0.05，即在3 個(gè)季節(jié)樣品中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；其中反-2-辛烯醛、1-己醇、（反,反）-2,4-庚二烯醛、壬醛、脫氫芳樟醇、2,2,6-三甲基環(huán)己酮在3 個(gè)組別樣品中存在顯著性差異（P＜0.01）；而VIP值大于1的順-茉莉酮的P值小于0.001，表明其含量在組別間表現(xiàn)出極為顯著的差異性，與PLS-DA的分析結(jié)果一致。此外，3,5-辛二烯-2-酮、1-壬醇、2-甲基呋喃及1-乙基-1-吡咯-2-甲醛的檢驗(yàn)結(jié)果與PLS-DA差異較大，并未在組別間呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，在綜合了PLS-DA及兩種非參數(shù)檢驗(yàn)分析結(jié)果之后，鑒定出春、夏及秋季綠茶中的關(guān)鍵差異性成分有12 種。

表3 16 種PLS-DA模型中VIP值大于1的揮發(fā)性化合物的P值及香氣特征Table3 The 16 volatile components with VIP ＞1 in PLS-DA model and their P values and aroma characteristics

2.3 不同季節(jié)綠茶關(guān)鍵成分的HCA

為了更直觀體現(xiàn)這12 種關(guān)鍵差異性化合物在三季綠茶中的分布情況，進(jìn)一步采用HCA法[30-31]對(duì)這12 種關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行分析，生成的熱圖如圖4所示。這12 種關(guān)鍵差異性成分在春、夏及秋季綠茶中的含量分布上具有一定的規(guī)律性（圖中化合物相對(duì)含量從綠色到紅色為逐漸升高）：I區(qū)內(nèi)化合物（反-2-辛烯醛、（反,反）-2,4-庚二烯醛、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、β-環(huán)檸檬醛、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮）在大部分夏茶中具有最高的含量，這些化合物主要為醛類和酮類，香氣特征普遍偏甜香和脂肪香（表3，序號(hào)4、5、7～8、11）。由于茶樹(shù)品種及種植地區(qū)的差異性較大，以上化合物在夏茶的不同樣本間也顯現(xiàn)出較大的差異性，如反-2-辛烯醛及（反,反）-2,4-庚二烯醛在永川種植的碧香早和福鼎大白茶中的含量最高，2,2,6-三甲基環(huán)己酮在銅仁福鼎大白茶、迎霜及安慶舒茶早中的含量最高，而β-環(huán)檸檬醛及5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮在安慶皖茶91中的含量要顯著低于其他夏茶。

II區(qū)內(nèi)化合物（1-庚醇、苯甲醇、3-甲基呋喃、壬醛、順-茉莉酮及1-己醇）在大部分春茶中的含量高于其他兩季，其中醇類化合物數(shù)量最多，包括低沸點(diǎn)的鏈狀脂肪醇和高沸點(diǎn)的苯甲醇，其中苯甲醇的含量最高，春季相對(duì)含量平均值為0.67±0.27、夏季0.20±0.05、秋季0.18±0.13；春季綠茶中銅仁的迎霜、福鼎大白茶以及安慶皖茶91中苯甲醇的含量分布更為顯著。與苯甲醇分布略有不同的是，銅仁地區(qū)的茶樹(shù)品種中3-甲基呋喃、壬醛及1-己醇在春、夏及秋季綠茶樣品中的含量并未顯現(xiàn)明顯差異性，而其他地區(qū)或品種的茶葉樣品中以上化合物的含量在春季中的含量顯著高于其他兩季。順-茉莉酮是新茶的重要成分之一，有強(qiáng)烈而愉快的茉莉花香，對(duì)春茶優(yōu)異香氣品質(zhì)形成起著重要的貢獻(xiàn)作用[22,32-33]，在本研究中與PLS-DA及非參數(shù)檢驗(yàn)分析結(jié)果對(duì)應(yīng)的是，順-茉莉酮在含量分布上的變化趨勢(shì)最為明顯，其含量在春茶中遠(yuǎn)高于夏、秋季綠茶，被鑒定為春茶的特征性香氣成分；尤其在永川碧香早及福鼎大白茶中其相對(duì)含量（3.72±0.19，3.57±0.92）比其他春茶樣品高出2～3 倍之多。II區(qū)內(nèi)化合物的香氣特征普遍為草本的清香及花果香（表3，序號(hào)1、2、6、9、13、14），這與春茶的感官審評(píng)結(jié)果較為一致[34-37]，說(shuō)明它們可能對(duì)春茶優(yōu)質(zhì)香氣品質(zhì)形成起著重要作用。

相比春、夏綠茶，秋季綠茶的關(guān)鍵香氣成分最少，并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，僅脫氫芳樟醇的含量在大部分秋茶中高于其他兩季，其香氣特征為清香、花香及木香（表3，序號(hào)10），其中安慶地區(qū)的舒茶早及皖茶91的秋茶樣品中脫氫芳樟醇的相對(duì)含量最高（4.58±0.61，2.3 2±0.2 8），永川品種次之（1.8 8±0.0 2，1.10±0.22），而銅仁地區(qū)的品種中該化合物的含量并未體現(xiàn)明顯的季節(jié)差異性。由此可見(jiàn)，脫氫芳樟醇的含量不僅與季節(jié)顯著相關(guān)，產(chǎn)地因素也是影響其分布的重要因素之一。而2,2,6-三甲基環(huán)己酮、1-己醇及壬醛等化合物僅在部分品種的秋季綠茶中有較高含量，如2,2,6-三甲基環(huán)己酮在福鼎大白品種中含量最高，1-己醇及壬醛在產(chǎn)自銅仁地區(qū)的茶樣中含量最高，可能是相應(yīng)品種或地區(qū)的綠茶所具有的個(gè)體屬性。

圖4 12 種關(guān)鍵差異性香氣成分在不同季節(jié)綠茶中的含量分布熱圖Fig.4 Heat map of 12 key aroma components among green teas harvested in different seasons

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME技術(shù)結(jié)合GC-MS技術(shù)，對(duì)春、夏、秋3 季綠茶中的32 種香氣成分進(jìn)行定性定量分析。這些化合物根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為醇類14 種、酮類4 種、醛類7 種、酯類2 種、雜環(huán)類3 種、烷類1 種、其他1 種等，其中醇類的種類最多，烷類和其他類最少。研究結(jié)果表明，不同季節(jié)的綠茶中共有香氣物質(zhì)含量的差異性對(duì)其香氣類型造成了一定的影響[38]，醇類在春、夏、秋季綠茶中含量均最高。采用基于揮發(fā)性化合物相對(duì)含量的PLS-DA模型將3 個(gè)不同季節(jié)的綠茶成功區(qū)分，并鑒定出VIP值大于1的差異性香氣成分16 種；繼而采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法輔助驗(yàn)證分析結(jié)果，確定在3 個(gè)季節(jié)間具有極顯著性差異的化合物1 種（順-茉莉酮）、顯著性差異化合物6 種（反-2-辛烯醛、1-己醇、（反,反）-2,4-庚二烯醛、壬醛、脫氫芳樟醇及2,2,6-三甲基環(huán)己酮）及差異性化合物5 種（苯甲醇、β-環(huán)檸檬醛、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、3-甲基呋喃及1-庚醇）。進(jìn)一步的聚類分析結(jié)果表明，醇類及順-茉莉酮等化合物在春茶中含量顯著高于其他季節(jié)，它們的香氣特征普遍為草本的清香及花果香；夏茶中甜香及脂肪香的醛酮化合物含量較高，其中（反,反）-2,4-庚二烯醛含量最高[39]；秋茶中的關(guān)鍵香氣成分種類最為單一，僅清香、花香及木香型的脫氫芳樟醇的含量相對(duì)較高，其余化合物并未在秋茶中有明顯規(guī)律性。此外，由于茶樹(shù)品種及種植地區(qū)的差異性較大，因此盡管生產(chǎn)季節(jié)相同，不同品種及地區(qū)的綠茶樣品仍存在一定的差異性，如脫氫芳樟醇的含量具有一定的地域特征性，順-茉莉酮在福鼎大白品種的含量最高。然而，由于本研究旨在查明不同季節(jié)茶葉樣品間的關(guān)鍵差異性化合物，因此在樣品選擇上更多考慮季節(jié)因素，并鑒定出不同地區(qū)及茶樹(shù)品種來(lái)源的茶葉中的共有差異性物質(zhì)。在今后的研究中，將擴(kuò)大樣本量研究茶葉產(chǎn)區(qū)及品種對(duì)茶葉香氣品質(zhì)的具體影響，以期為科學(xué)分析和評(píng)價(jià)不同季節(jié)綠茶的香氣品質(zhì)奠定良好的理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)優(yōu)良茶樹(shù)品種選育提供一定的參考依據(jù)。