馮 濤，王旭增，王一非，孫 敏，姚凌云，徐志民

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.路易斯安拉州立大學(xué)食品科學(xué)系，美國(guó) 路易斯安那 巴吞魯日 70802）

隨著人們生活水平的提高，葡萄酒逐漸在我國(guó)被普遍接受。同時(shí)出于綠色釀造和健康飲用的理念，越來(lái)越多的人開(kāi)始自己在家中釀制葡萄酒，不僅能夠享受到綠色釀造的樂(lè)趣，還能品嘗到天然無(wú)添加的葡萄酒。家庭自釀多采用鮮食葡萄作為釀酒原料，酵母菌是生產(chǎn)葡萄酒的主要微生物菌群，是葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵因素，葡萄酒的釀造都是在酵母菌的作用下，采用自然發(fā)酵或者純種發(fā)酵，將葡萄原料中的各種潛在成分在酒中充分表現(xiàn)出來(lái)[1]，因此葡萄酒酵母篩選歷來(lái)很受重視[2]。

目前的市售酵母中，針對(duì)鮮食葡萄發(fā)酵的家釀葡萄酒酵母種類較少，鮮食葡萄釀酒酵母菌株主要篩選自葡萄的果皮、土壤或是在葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中篩選。徐建東等[3]從鮮食葡萄龍眼的葡萄皮及種植土壤中篩選出一株低醇酵母菌株F12，譚海剛等[4]從鮮食葡萄紅提等的葡萄園土壤中篩選出耐乙醇酵母菌株QY29，葛含靜[5]從鮮食葡萄戶太八號(hào)的醪液中分離出起酵快、發(fā)酵穩(wěn)定的酵母菌株S37，以上篩選出的酵母菌株均具有一定的優(yōu)勢(shì)。在多年種植鮮食葡萄的園區(qū)中，有多種天然酵母與其相伴而生，經(jīng)長(zhǎng)期的自然選擇和進(jìn)化演變，逐漸形成一批適合鮮食葡萄發(fā)酵的天然優(yōu)勢(shì)酵母，從中可以篩選出具有優(yōu)良品質(zhì)的鮮食葡萄酒酵母[6]，這種具有獨(dú)特風(fēng)格的釀酒酵母顯得非常重要[7]。在葡萄栽培以及釀酒歷史悠久的歐洲，尤其是在名酒產(chǎn)地，目前仍然利用優(yōu)越的天然酵母群進(jìn)行發(fā)酵。我國(guó)的各大葡萄酒廠十分重視自己酵母的選育，如山東煙臺(tái)張?jiān)ａ劸乒具x育的7318、7448酵母等[8]，郭志剛等[9]利用都善紅葡萄分離篩選葡萄酒酵母，發(fā)酵都善紅葡萄釀制成了具有特色的名酒“樓蘭古酒”。這些酵母為葡萄酒特色和品牌的形成奠定了基礎(chǔ)[10]。

中國(guó)的鮮食葡萄產(chǎn)量已連續(xù)多年為世界第一，但是鮮食葡萄加工業(yè)相對(duì)落后，對(duì)釀酒上的研究更少[11]，除了鮮食葡萄皮薄肉質(zhì)硬、出汁率低以及含糖量低等因素外，缺乏針對(duì)鮮食葡萄發(fā)酵的釀酒酵母[12]，同樣是鮮食葡萄發(fā)酵酒的香氣和風(fēng)味欠佳的重要原因之一，所以篩選出一種針對(duì)鮮食葡萄酒發(fā)酵、產(chǎn)生優(yōu)良香氣的釀酒酵母尤為必要。因此從天然酵母中，篩選出針對(duì)鮮食葡萄發(fā)酵的家釀葡萄酒酵母是一項(xiàng)十分有意義和有價(jià)值的工作。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從葡萄種植土壤中對(duì)鮮食葡萄釀酒酵母的篩選方法和釀造酒的香氣分析進(jìn)行探索，為今后開(kāi)展這方面的研究工作積累經(jīng)驗(yàn)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醉金香葡萄購(gòu)于上海松江區(qū)，采摘于2016年8月份，含糖量16.8%，總酸0.61%，平均粒質(zhì)量13 g。土壤樣品分別由上海奉賢、上海崇明、上海松江、湖北武漢、浙江紹興、山東菏澤、遼寧鐵嶺等地葡萄園土壤中采集得到。

安琪葡萄酒酵母 上海市安琪酵母有限公司；帝伯仕葡萄酒酵母 山東煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；GBS酵母DNA試劑盒 南京捷倍思生物基因技術(shù)有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯9.0 g/L，葡萄糖22.0 g/L，瓊脂13.0 g/L，按上述配方配好后加熱溶解，pH 6.5±0.2，121 ℃滅菌20 min；酵母浸出粉葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，按上述配方配好后加熱溶解，pH 6.5±0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器公司；SPX-150B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅有限公司；DHG-9145A恒溫干燥箱 上海一恒科技有限公司；GL-21B高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SelectCycler II聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄園土壤中釀酒酵母的分離活化

富集酵母菌[13]：取土壤樣品10 g，加入到200 mL無(wú)菌水中，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中200 r/min培養(yǎng)20 min。

酵母菌分離：取上述培養(yǎng)液1 mL進(jìn)行梯度稀釋，分別吸取10-3、10-4和10-5梯度的稀釋液200 μL涂布于PDA平板[14]，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后挑取菌落染色鏡檢，篩選酵母菌，經(jīng)2～3 次劃線分離[15]，得到酵母純培養(yǎng)物。

酵母菌活化：將上述酵母純培養(yǎng)物接種至YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物6 000 r/min離心10 min[16]，重復(fù)兩次得到酵母，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 26S rDNA鑒定

利用GBS酵母DNA提取試劑盒提取酵母菌的DNA，以DNA基因組為模板，以真菌26S rDNA D1區(qū)通用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。

PCR擴(kuò)增采用50 μL體系：ddH2O 18 μL，10 μmol/L引物NL12 μL，10 μmol/L引物NL42 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，5 U TaqE酶25 μL，酵母菌DNA模板2 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min，36 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)序并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性序列比對(duì)分析[18]。根據(jù)同源序列的比對(duì)結(jié)果，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)模式菌株，利用MEGA 7.0軟件計(jì)算菌株進(jìn)化距離[19]，運(yùn)用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建分離出的生香酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 葡萄汁發(fā)酵

稱取1 kg“醉金香”白葡萄，洗凈破碎后得到葡萄醪，加入1 L發(fā)酵罐內(nèi)并添加調(diào)硫片（200 mg/L）。將發(fā)酵罐于20～25 ℃靜置，使葡萄皮中的呈香、呈味物質(zhì)浸漬到葡萄醪，24 h后用比重計(jì)（量程1.0～1.1）和溫度計(jì)分別測(cè)其相對(duì)密度和溫度，并測(cè)定其清汁糖度，根據(jù)所測(cè)糖度補(bǔ)充葡萄糖，將糖度調(diào)節(jié)至25 °Brix[20]。將酵母分別按照107CFU/mL接入葡萄醪，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。每天定時(shí)測(cè)定葡萄醪的相對(duì)密度變化，當(dāng)酒液的相對(duì)密度接近0.997連續(xù)2 d保持不變即視為發(fā)酵完成，終止發(fā)酵[21]，將酒液進(jìn)行澄清，過(guò)濾處理后放入低溫環(huán)境（12 ℃）貯存。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的基本指標(biāo)，測(cè)定葡萄酒樣的基本理化指標(biāo)（總糖含量、總還原糖含量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酸含量、總揮發(fā)酸含量、總二氧化硫含量）。

1.3.4 感官評(píng)定

建立感官評(píng)定小組，由12 位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員[22]（6 男6 女，年齡范圍為25～30 歲）組成，培訓(xùn)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)ISO13300-2-2006[23]制定，評(píng)定方法按照J(rèn)ackson[24]的感官環(huán)境和操作步驟進(jìn)行，并引用Rutan等[25]的感官分析方法，根據(jù)實(shí)際情況建立對(duì)葡萄酒的呈香感官描述（表1）。評(píng)定方法為9 分嗜好法，0～9 分表示風(fēng)味逐漸增強(qiáng)，其中0 分代表沒(méi)有被察覺(jué)，9 分代表風(fēng)味強(qiáng)度最大。每種發(fā)酵酒感官評(píng)定3 次，取平均值。

表1 葡萄酒香氣評(píng)價(jià)[25]Table1 Flavor descriptions of wine

1.3.5 發(fā)酵酒中揮發(fā)性香氣成分的提取檢測(cè)

固相微萃取[26]：取5 mL發(fā)酵酒于15 mL頂空瓶中恒溫（55 ℃）水浴，并向頂空瓶中加入20 μL 2-辛醇（600 mg/L），用蓋子密封后插入75 μL CAR/PDMS萃取頭，保持30 min。

G C條件[27]：H P-I N N O WA X毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始溫度40 ℃，保留2 min，以5 ℃/min的速率升至230 ℃，保留15 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣He，流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣。MS條件：四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍10～450 u。

定性分析：利用全離子掃描質(zhì)譜圖[28]，參考NIST11譜圖庫(kù)資料進(jìn)行分析，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)（retention index，RI）相比較，或與同條件下該物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品的RI和MS圖像比較，以確定某物質(zhì)。定量分析：利用2-辛醇內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。計(jì)算如式（1）、（2）所示：

式中：tx為揮發(fā)性物質(zhì)的保留時(shí)間/min；tz為與揮發(fā)性物質(zhì)碳原子屬相同的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；z為揮發(fā)性物質(zhì)的碳原子數(shù)。

式中：wi為揮發(fā)性物質(zhì)含量/（mg/kg）；ms為內(nèi)標(biāo)物含量/μg；Ai為揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；m0為發(fā)酵酒樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)測(cè)定香氣物質(zhì)的香氣活力值（odour active value，OAV）評(píng)定發(fā)酵酒的關(guān)鍵香氣成分。OAV為特定化合物樣品氣味的重要指標(biāo)，其數(shù)值等于化合物的濃度與水中的嗅覺(jué)閾值的比值[29]。

分析OAV大于1的化合物與酵母發(fā)酵酒的相關(guān)性，采用Unscrambler 9.7進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化與標(biāo)準(zhǔn)化（1/Sdev）處理，顯著差異水平取P小于0.05[30]，模型采用Full Cross-Validation進(jìn)行校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母的分離篩選

從各地的葡萄園土壤樣品中經(jīng)過(guò)多次分離純化，得到16 株菌，其中3 株為霉菌（Mould），3 株為放線菌（Actinomycesbovis），6 株為熱帶念珠菌（C.tropical），通過(guò)對(duì)菌株觀察和鏡檢，有4 株初步確定為酵母菌株（圖1），以下簡(jiǎn)稱S1、S2、S3、S4。從分離結(jié)果可以看出（圖1），酵母菌菌落都為圓形，乳白色，其中S2、S3、S4三株菌表面不光滑，S1表面光滑。細(xì)胞的生殖方式都為芽殖，S1、S3兩株菌具有圓形和橢圓形兩種形態(tài)，S2、S4只有橢圓形態(tài)。

圖1 酵母菌株菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of four yeast isolates

2.2 酵母菌屬的鑒定結(jié)果

圖2 S1、S2、S3酵母系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 S1, S2, S3 yeast phylogenetic tree

將S1、S2、S3、S4這4 株酵母測(cè)序數(shù)據(jù)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索匹配（BLAST），建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[31]。S1、S2、S3結(jié)果如圖2所示，菌株S1和釀酒酵母（S. cerevisiae strain S2-39）具有較高的同源性，相似度為99%；菌株S2和釀酒酵母（S. cerevisiae strain NL5）具有較高的同源性，相似度為99%；菌株S3和釀酒酵母（S. cerevisiae strain CTBRL87）具有較高的同源性，相似度為100%。菌株S4結(jié)果如圖3所示，異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus culture-collection CBS：262）具有較高的同源性，相似度為100%。結(jié)合以上比對(duì)結(jié)果，將S1、S2、S3三株酵母鑒定為釀酒酵母（S. cerevisiae），將S4鑒定為異常威克漢遜酵母（W. anomalus）。

圖3 S4酵母系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of yeast S4

2.3 發(fā)酵酒的主要理化指標(biāo)分析

比較不同的酒樣可以看出，不同酵母發(fā)酵的葡萄酒各項(xiàng)指標(biāo)均存在差異（表2），乙醇體積分?jǐn)?shù)從高到底依次為S3＞S1＞S4＞S2＞安琪＞帝伯仕。殘?zhí)橇浚偺呛浚┛梢苑从辰湍笇?duì)糖的利用能力，在初始糖度相同的情況下，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康?，說(shuō)明酵母對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用率高，則發(fā)酵能力強(qiáng)[32]。由表2可以看出，總糖含量和總還原糖含量均與乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)應(yīng)，表明菌株利用糖類的能力較強(qiáng)，發(fā)酵徹底。總酸含量可以判定酵母的產(chǎn)酸能力，酸類物質(zhì)是酒中的主要呈味物質(zhì)，其含量對(duì)酒的色澤和風(fēng)味具有一定的影響[33]。6 種酒樣總酸含量為S4＞S3＞S2＞安琪＞S1＞帝伯仕，總揮發(fā)酸含量為S1＞S4＞S2＞帝伯仕＞S3＞安琪，說(shuō)明菌株產(chǎn)酸水平高于商業(yè)酵母。二氧化硫作為抗氧化劑和微生物抑制劑，在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[34]。但是過(guò)量的二氧化硫會(huì)破壞食品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并對(duì)人體造成危害[35]。經(jīng)過(guò)檢測(cè)（表2），發(fā)酵酒中總二氧化硫含量均符合GB/T 15038—2006（≤250 mg/L）。

初步估算零層板厚度為250mm，可以作為上部結(jié)構(gòu)嵌固端考慮，因此，上部模型可以將-0.5m定為嵌固端進(jìn)行結(jié)構(gòu)計(jì)算。在確定各主受力構(gòu)件尺寸之后，可以進(jìn)行下一步基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。

表2 理化指標(biāo)分析結(jié)果Table2 Physical and chemical indicators of wines

2.4 發(fā)酵酒揮發(fā)性香氣成分分析

利用頂空固相微萃取GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)篩選出的4 種酵母發(fā)酵酒進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，并用市售安琪酵母和帝伯仕酵母發(fā)酵酒作為對(duì)比。共檢測(cè)到45 種共8 大類香氣化合物（表3），包括酯類15 種，醇類12 種，萜烯類5 種，醛類5 種，酸類4 種，酮類3 種，酚類2 種。6 種發(fā)酵酒中共有的揮發(fā)性化合物為：乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁醇、異戊醇、苯乙醇，2,3-丁二醇、2-辛酮等，可鑒定為6 種發(fā)酵酒中的主要香氣物質(zhì)，與文彥[36]的研究相符合。

表3 6 種發(fā)酵酒的揮發(fā)性成分及相對(duì)含量Table3 Volatile components and their contents in wines

續(xù)表3

由表3可知，S1發(fā)酵酒中共檢測(cè)出33 種揮發(fā)性化合物，其中酯類11 種，醇類9 種，酸類4 種，醛類3 種，酮類3 種，烯萜類2 種，酚類1 種，比安琪酵母發(fā)酵酒多10 種（十二酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸甲酯、十六酸乙酯、苯乙酮、香葉基丙酮、檸檬烯E、β-柏木烯、2-甲基丁醇、2-乙基己醇），比帝伯仕酵母發(fā)酵酒多5 種（乙酸異丁酯、十四酸乙酯、十六酸甲酯、壬醛、癸醛）。酯類物質(zhì)產(chǎn)生于酵母或細(xì)菌代謝及葡萄酒陳釀，賦予葡萄酒果香和花香[37]，十四酸乙酯具有甜奶油的氣味，十六酸乙酯具有水果和香草的氣味[38]，乙酸異丁酯具有生梨和覆盆子的香氣[39]。醛和酮主要是由酸的脫羧和醇的氧化形成[40]，香葉基丙酮具有花香和熱帶水果香的氣息[41]，壬醛具有瓜香和堅(jiān)果香，癸醛具有橘皮的香味。

S2發(fā)酵酒中共檢測(cè)出38 種揮發(fā)性化合物，為6 種發(fā)酵酒中物質(zhì)種類最多的酒樣。其中酯類13種，醇類10 種，酸類4 種，醛類3 種，酮類2 種，烯萜類4 種，酚類2 種，比安琪酵母發(fā)酵酒多15種（十二酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸甲酯、十六酸乙酯、2-甲基丁醇、2-乙基己醇、壬醛、香葉基丙酮等），比帝伯仕酵母發(fā)酵酒多10種（乙酸異丁酯、十四酸乙酯、十六酸甲酯、乙酸苯乙酯、檸檬烯E、β-柏木烯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚等）。烯萜類和雜環(huán)類物質(zhì)的含量較低，但對(duì)增加葡萄酒風(fēng)味的豐富性起重要作用[42]，檸檬烯E屬單萜類化合物，具有類似檸檬的味道[43]。多酚類化合物是葡萄中重要的抗氧化類化合物[44]，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚具有輕度樟腦氣味。

相對(duì)于商業(yè)酵母，S3發(fā)酵酒中庚酸乙酯、乙酸異丁酯、乙醇、丙醇、正己醇、乙酸含量明顯高于商業(yè)酵母，尤其是乙醇含量，居6 種酵母發(fā)酵酒之首；S4發(fā)酵酒中苯乙醇和乙酸含量明顯高于商業(yè)酵母，其乙酸含量為6 種發(fā)酵酒中最高。

結(jié)合以上對(duì)比分析可以看出，相對(duì)于商業(yè)酵母，篩選酵母發(fā)酵產(chǎn)生的獨(dú)有的化合物，尤其是S1和S2發(fā)酵酒中，均包括十二酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、2-甲基丁醇、2-乙基己醇、壬醛、癸醛、檸檬烯E、β-柏木烯等，說(shuō)明從土壤中篩選的釀酒酵母，發(fā)酵鮮食葡萄產(chǎn)生更多以上化合物。

2.5 關(guān)鍵揮發(fā)性化合物OAV

僅通過(guò)香氣物質(zhì)的種類和相對(duì)含量，無(wú)法準(zhǔn)確鑒定各種化合物對(duì)發(fā)酵酒香氣的貢獻(xiàn)大小，因此引入OAV，進(jìn)一步探究發(fā)酵酒中的關(guān)鍵揮發(fā)性香氣物質(zhì)。Allen等[45]研究發(fā)現(xiàn)OAV大于1的化合物對(duì)酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)顯著，且OAV越大對(duì)香氣貢獻(xiàn)程度越高，但OAV小于1的物質(zhì)并非對(duì)香氣不起作用，這些物質(zhì)往往起協(xié)香作用。對(duì)GC-MS的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算OAV，結(jié)果如表4所示，共有15 種物質(zhì)OAV大于1，被認(rèn)為是發(fā)酵酒香氣的關(guān)鍵組分，其中8 種物質(zhì)OAV大于10，5 種物質(zhì)（丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯）OAV大于100，2 種物質(zhì)（丁酸乙酯、癸酸乙酯）OAV大于1 000。這些物質(zhì)被認(rèn)為是發(fā)酵酒中必不可少的香氣物質(zhì)，且其全部為酯類，說(shuō)明酯類是發(fā)酵葡萄酒中的特征香氣物質(zhì)，與Styger等[46]的研究結(jié)果一致。

表4 6 種酵母發(fā)酵酒中揮發(fā)性物質(zhì)的OAV（OAV＞1）Table4 OAV of volatile substances in six wines (OAV ＞ 1)

2.6 揮發(fā)性化合物主成分相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確6 種酵母發(fā)酵葡萄汁香氣成分的差異，以及香氣物質(zhì)的呈香關(guān)系，采用PCA模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。如圖4所示，第1象限中，與S1發(fā)酵酒香氣物質(zhì)相關(guān)的是癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸、癸酸，這些物質(zhì)的香氣描述符合花香、玫瑰香、甜水果香等[49]，與其在S1發(fā)酵酒中OAV較高相對(duì)應(yīng)；第2象限中，對(duì)S2發(fā)酵酒貢獻(xiàn)較大化合物有丁酸乙酯、庚酸乙酯等，這些物質(zhì)具有葡萄、香蕉、櫻桃的果香氣味[37]，同時(shí)在S2發(fā)酵酒中具有較高的OAV。以PC1為基準(zhǔn)，S1發(fā)酵酒明顯區(qū)別于其他酒樣；以PC2為基準(zhǔn)，S2明顯區(qū)別于其他酒樣[50]，說(shuō)明S1和S2發(fā)酵酒的香氣評(píng)價(jià)最好。S3發(fā)酵酒和安琪酵母發(fā)酵酒PCA結(jié)果接近，同時(shí)對(duì)兩者貢獻(xiàn)較大的香氣物質(zhì)有乙酸乙酯（葡萄和櫻桃香）、丁酸乙酯（蘋(píng)果香）、乙酸異戊酯（香蕉香），說(shuō)明兩種發(fā)酵酒的果香，尤其是蘋(píng)果、葡萄以及香蕉的香氣比較接近[51]。

圖4 15 種OAV大于1的揮發(fā)性化合物對(duì)前兩個(gè)主成分的PCA圖Fig.4 PCA of 15 volatile compounds with OAV greater than1 to the fi rst two principal components

圖5 6 種酵母發(fā)酵酒香氣評(píng)價(jià)圖Fig.5 Radar map of aroma evaluation of6 wines

3 結(jié) 論

從上海崇明、浙江紹興、山東菏澤、武漢4 個(gè)地區(qū)的葡萄園土壤中成功分離出4 株酵母菌，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察對(duì)比，并用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果表明：S1、S2、S3為釀酒酵母，S4

為異常威克漢遜酵母。將4 株酵母對(duì)同一種鮮食葡萄醉金香進(jìn)行發(fā)酵，并用市售安琪酵母和帝博仕酵母發(fā)酵酒作為對(duì)照。對(duì)發(fā)酵酒的揮發(fā)性香氣成分使用頂空固相微萃取進(jìn)行收集，并結(jié)合GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析，共檢測(cè)到45 種共8 大類香氣成分，包括醇類12 種，酯類15 種，烯萜類5 種，醛類5 種，酸類4 種，酮類4 種，酚類2 種。相對(duì)于商業(yè)酵母發(fā)酵酒，S1發(fā)酵酒能夠產(chǎn)生更高含量的辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯，S2發(fā)酵酒中癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸、癸酸、香葉基丙酮、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚含量較高，S3發(fā)酵酒具有高的乙酸乙酯含量和乙醇含量，S4發(fā)酵酒具有更高的乙酸含量。本實(shí)驗(yàn)探究了篩選酵母和商業(yè)酵母在發(fā)酵鮮食葡萄醉金香產(chǎn)香方面的差異，為今后篩選鮮食葡萄發(fā)酵酵母的方向作出了展望，也為對(duì)鮮食葡萄的基因改良提供了方向。