張婧婷，施俊鳳*，范三紅,*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

果蔬采后病害的發(fā)生是導(dǎo)致其產(chǎn)后損失的主要原因，目前化學(xué)殺菌劑的使用仍是減少病害的主要措施[1]。但是化學(xué)殺菌劑容易引起殘留污染、病原菌產(chǎn)生抗藥性、以及對(duì)動(dòng)物和人體健康產(chǎn)生威脅等一系列問(wèn)題[2]。利用拮抗微生物進(jìn)行果蔬產(chǎn)后防治具有很好的前景[3]，引起世界各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注[4]。

洋蔥伯克氏菌群是一類基因型不同、表型相近的菌株復(fù)合群[5-6]，廣泛存在于土壤、水和植物根際，具有生物防治、生物降解、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種功能[7-9]。洋蔥伯克氏菌（Burkholderia contaminans）對(duì)梨青霉病（Penicillium expansum）[10]、香蕉炭疽?。–olletotrichum musae）[11]、甜櫻桃褐腐?。⊿clerotinia laxa）[12]和葡萄灰霉?。˙otrytis cinerea）[13]等各種采后病害具有生物防治效果。本實(shí)驗(yàn)室篩選的洋蔥伯克氏菌，研究表明其不僅可以有效防止葡萄、草莓、番茄等果實(shí)的采后腐爛，而且對(duì)果蔬采后常見(jiàn)病原真菌有較好的抑制作用[14]。本實(shí)驗(yàn)研究該菌株抗菌蛋白分離純化的方法，并探究其生物學(xué)性質(zhì)，不僅能夠開(kāi)發(fā)新的微生物資源，而且為克隆基因表達(dá)蛋白，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拮抗菌洋蔥伯克氏菌（B. contaminans）B-1菌株由本實(shí)驗(yàn)室從杏果實(shí)表面分離，并根據(jù)核糖體26S D1/D2區(qū)和ITS區(qū)核甘酸序列比對(duì)及生理生化特性鑒定。B-1發(fā)酵培養(yǎng)基YSP[15]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

病原菌灰葡萄孢霉（B. cinerea）：從發(fā)病葡萄果實(shí)分離，并通過(guò)ITS區(qū)進(jìn)行鑒定。PDA培養(yǎng)基[16]的配制用于病原菌活化及活性檢測(cè)，配方為馬鈴薯200 g（小塊煮取汁），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000）、纖維素DE-52、Sephadex G-100葡萄糖凝膠 北京Solarbio科技有限公司；過(guò)硫酸銨 美國(guó)Sigma公司；四甲基乙二胺美國(guó)Ameresco公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 北京艾德萊生物科技有限公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-II離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；XO-650D超聲波細(xì)胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司；TH-500梯度混合器、DHL-A電腦數(shù)顯恒流泵、DBS-100D電腦全自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；DYVZ-24DN電泳槽、DYY-2C電泳儀北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，蛋白含量的測(cè)定采用Bradford染色法[17]。

1.3.2 抑菌活性的檢測(cè)

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法[18]測(cè)定抑菌活性，無(wú)菌瓊脂打底，放入牛津杯，倒入混有灰葡萄孢子（1×105CFU/mL）的培養(yǎng)基，形成帶孔平板，每孔加200 μL待測(cè)液體。26 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.3 B-1抗菌蛋白的粗提

菌種B-1活化后以1%接種量至發(fā)酵培養(yǎng)基YSP中發(fā)酵（28 ℃，200 r/min）培養(yǎng)24 h后，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄上清液，收集菌體沉淀，用磷酸緩沖液洗滌多次，加入原菌液體積的1/5～1/10的裂解液冰浴超聲裂解（300 W，10 s/10 s，20 min）。裂解液中加入硫酸銨粉末至10%飽和度，4 ℃靜置過(guò)夜，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液和沉淀，上清液參考1.3.1節(jié)測(cè)定蛋白含量，沉淀參考1.3.2節(jié)檢測(cè)活性。

按同樣的方法在上清液中加入硫酸銨至飽和度為0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，確定飽和度范圍。

收集蛋白沉淀，充分透析除鹽，BaCl2飽和溶液檢查透析是否完全[19]，冷凍干燥濃縮除菌，使其最終質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。

1.3.4 纖維素DE-52離子交換層析

取5 mL粗蛋白溶液上樣于經(jīng)0.05 mol/L、pH 7.1的Tris-HCl緩沖溶液平衡后的DE-52離子交換層析柱，用0～2 mol/L NaCl的Tris-HCl（0.05 mol/L、pH 7.1）緩沖溶液梯度洗脫，洗脫速率為1.5 mL/min，每管收集5 mL。收集洗脫液，以管子數(shù)目為橫坐標(biāo)，吸光度（A280nm）為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。收集每個(gè)洗脫峰，將每個(gè)洗脫峰經(jīng)PEG-6000濃縮、透析除鹽、0.22 μm過(guò)濾器除菌，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液，參照1.3.2節(jié)進(jìn)行活性檢測(cè)，對(duì)活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

1.3.5 G-100葡聚糖凝膠層析

將抗菌活性強(qiáng)的蛋白粗提液經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠層析柱G-100，上樣量為2 mL，洗脫液為Tris-HCl（0.05 mol/L、pH 7.1）緩沖溶液，洗脫速率為0.5 mL/min，每管收集2 mL。將收集到的各個(gè)洗脫峰按照1.3.4節(jié)繪制洗脫曲線。參照1.3.2節(jié)檢測(cè)活性。將有活性的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)。1.3.6 SDS-PAGE

參照Laemmli等[20]方法，配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，5 μL樣品與15 μL的4×loading buffer沸水浴煮沸5 min，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品同時(shí)電泳，濃縮膠電壓為80 V，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠，將電壓調(diào)至120 V，待電泳結(jié)束后剝膠，染色脫色拍照，并根據(jù)條帶進(jìn)行分析。

1.3.7 B-1抑菌物質(zhì)特性的測(cè)定

1.3.7.1 熱穩(wěn)定性

將1.3.3節(jié)的粗蛋白溶液分別置于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃處理30 min，未經(jīng)處理的蛋白溶液作為對(duì)照[21]。參照1.3.2節(jié)測(cè)定活性。

1.3.7.2 pH值穩(wěn)定性

用2 mol/L的NaOH和HCl溶液，分別調(diào)節(jié)1.3.3節(jié)的粗蛋白溶液pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，室溫靜置24 h，未經(jīng)處理的蛋白溶液作對(duì)照[22]。參照1.3.2節(jié)測(cè)定活性。

1.3.7.3 有機(jī)試劑敏感性

參考紀(jì)兆林等[23]方法，取1.3.3節(jié)的粗蛋白溶液，按體積比1∶1分別加入甲醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正己烷搖勻靜置放4 h，若不分層直接濃縮，若分層分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，混合上下濃縮液，使各個(gè)濃縮液體積一致，未經(jīng)處理的蛋白溶液作對(duì)照。參照1.3.2節(jié)測(cè)定活性。

1.3.7.4 蛋白酶敏感性

參考Franco等[24]方法，向1.3.3節(jié)粗蛋白溶液中加入不同蛋白酶（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K），使蛋白酶最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，28 ℃水浴2 h，70 ℃水浴3 min使酶失活，未經(jīng)處理的粗蛋白作對(duì)照。參考1.3.2節(jié)測(cè)定活性。

1.3.7.5 紫外線敏感性

取5 份1.3.3節(jié)粗蛋白溶液于40 W紫外燈下距離20 cm分別輻照10、30、60、90、120 min，未經(jīng)處理的蛋白溶液為對(duì)照。參照1.3.2節(jié)測(cè)定活性。

1.3.7.6 常見(jiàn)試劑敏感性

參考Turgism等[25]方法，配制5、50 mg/mL的Tween-80、SDS、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和巰基乙醇，分別取20 μL與180 μL粗蛋白溶液混勻，28 ℃水浴2 h，未經(jīng)處理的蛋白溶液作對(duì)照。參照1.3.2節(jié)測(cè)定活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 85和Excel 2007軟件進(jìn)行處理分析，Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨飽和度的確定

圖1 不同飽和度上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量（A）及沉淀抑菌活性（B）Fig.1 Protein content (A) in supernatants after ammonium sulphate precipitation at different degrees of saturation and antimicrobial activity (B) of protein

從圖1A可以看出，經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀，上清液中的蛋白逐漸被沉淀下來(lái)。當(dāng)硫酸銨飽和度為10%和20%時(shí)，上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量很高，與0%相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）；當(dāng)飽和度為30%～50%時(shí)，與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)硫酸銨飽和度進(jìn)一步增加到80%時(shí)，上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量?jī)H為0.107 mg，當(dāng)飽和度繼續(xù)增加到100%，雖然上清液蛋白質(zhì)量有所降低，但與80%無(wú)明顯差異（P＞0.05）。從圖1B可看出，當(dāng)硫酸銨飽和度為0%～40%時(shí)，沉淀無(wú)活性；當(dāng)飽和度為50%～80%時(shí)，隨著硫酸銨飽和度的增大，抑菌圈也增大，且差異顯著（P＜0.05），飽和度為80%時(shí)，抑菌圈直徑大小為17 mm，但是隨著飽和度的增加，沉淀抑菌圈直徑差異不明顯（P＞0.05）。綜合考慮，選擇80%飽和度的硫酸銨沉淀蛋白。

2.2 纖維素DE-52離子交換層析和G-100葡聚糖凝膠層析結(jié)果

圖2 纖維素DE-52離子交換層析Fig.2 DEAE-cellulose DE-52 ion exchange chromatography

初始階段，用緩沖溶液充分洗脫，使A280nm小于0.02，并且保持恒定，再用含有NaCl的緩沖溶液線性緩沖。洗脫曲線如圖2所示，粗蛋白經(jīng)過(guò)纖維素DE-52離子交換層析，最后得到4 個(gè)蛋白峰，分別命名為D1、D2、D3和D4，收集各部分經(jīng)活性檢測(cè)，D2具有活性，其余無(wú)活性。將D2收集濃縮進(jìn)一步用G-100進(jìn)行葡聚糖凝膠層析，分子篩層析結(jié)果曲線如圖3所示，分離得到3 個(gè)蛋白峰，分別命名為G1、G2、G3，經(jīng)活性檢測(cè)，G3有活性，G1和G2沒(méi)有活性。

圖3 Sephadex G-100分子篩凝膠過(guò)濾層析Fig.3 Sephadex G-100 gel fi ltration chromatography

圖4A為經(jīng)離子交換層析得到各部分蛋白峰抑菌活性結(jié)果，分離得到的4部分蛋白峰，其中D2具有明顯的抑菌活性，其抑菌圈直徑為18 mm。圖4B為D2經(jīng)葡聚糖凝膠層析得到的結(jié)果，層析后得到3部分蛋白峰，經(jīng)抑菌活性檢測(cè)看出，G3具有抑菌活性，抑菌圈直徑為16 mm。

圖4 各個(gè)蛋白峰對(duì)灰霉菌的抑制效果Fig.4 Antifungal effect of all protein fractions against Botrytis cinerea

2.3 B-1抗菌蛋白分離純化結(jié)果

通過(guò)計(jì)算分離純化每步蛋白質(zhì)的質(zhì)量，從表1可以看出，經(jīng)硫酸銨沉淀得到7.5 mg粗蛋白溶液，最后可得到1.76 mg的目的蛋白，其得率為23.40%。

表1 B-1抗菌蛋白分離純化及其得率Table1 Puri fi cation steps of antifungal protein from B-1

2.4 SDS-PAGE分析結(jié)果

從圖5可看出，經(jīng)過(guò)每一步的分離純化，雜蛋白含量越來(lái)越低。經(jīng)80%的硫酸銨沉淀得到的蛋白中，蛋白種類非常多，經(jīng)過(guò)纖維素DE-52離子交換層析后，大部分雜蛋白被去除，在經(jīng)過(guò)分子篩層析后得到了一條達(dá)到電泳純的抗菌蛋白，同標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較，該抗菌蛋白分子質(zhì)量約為17.6 kDa。

圖5 SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE prof i les

2.5 粗蛋白的熱穩(wěn)定性結(jié)果

圖6 溫度對(duì)抑菌物質(zhì)的影響Fig.6 Inf l uence of temperature on stability of antimicrobial protein

如圖6所示，蛋白溶液在30 ℃和40 ℃處理30 min時(shí)，其活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。80 ℃處理30 min后，雖然抑菌活性有所下降，但仍為對(duì)照組的54.56%。說(shuō)明該蛋白具有一定的耐熱性。

2.6 粗蛋白的pH值穩(wěn)定性結(jié)果

圖7 pH值對(duì)抑菌物質(zhì)的影響Fig.7 Inf l uence of pH on stability of antimicrobial protein

如圖7所示，該抑菌物質(zhì)對(duì)酸堿的耐受性較強(qiáng)，pH 3～11下均有抑菌活性。pH 3時(shí)，抑制率為最適條件下的51.97%，pH 11時(shí)，抑菌率為29.44%。蛋白活性最強(qiáng)的pH值范圍為5～7，表明該蛋白在偏酸性及中性條件下穩(wěn)定性較好。

2.7 粗蛋白對(duì)有機(jī)試劑、蛋白酶和紫外線的敏感性結(jié)果

粗蛋白溶液經(jīng)有機(jī)試劑、蛋白酶和紫外照射處理后結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，均未有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明該抑菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)試劑、蛋白酶及紫外照射不敏感。圖8為抑菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)試劑和蛋白酶敏感性的效果圖。

表2 抑菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑、蛋白酶和紫外照射的敏感性Table2 Sensitivity of antimicrobial protein to organic solvents,proteases and UV irradiation

圖8 抑菌物質(zhì)對(duì)有機(jī)試劑（a）和蛋白酶（b）敏感性的效果圖Fig.8 Inhibition zones of antimicrobial protein in the presence of organic solvents (a) and proteases (b)

2.8 粗蛋白對(duì)常見(jiàn)試劑的敏感性

分別采用5 mg/mL和50 mg/mL兩個(gè)質(zhì)量濃度的試劑處理，由表3可知，Tween-80、EDTA和SDS與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而DTT和巰基乙醇則差異很大（P＜0.05）。采用DTT和巰基乙醇低質(zhì)量濃度處理時(shí)，蛋白仍具有輕微的抑菌作用，而當(dāng)質(zhì)量濃度增加時(shí)，抑菌活性喪失。DTT和巰基乙醇是常用的還原劑，可能會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，使其活性喪失。Tween-80在質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，抑菌物質(zhì)活性增強(qiáng)了12.5%。

表3 抑菌物質(zhì)對(duì)表面活性劑敏感性Table3 Sensitivity of antimicrobial protein to surfactants

3 討 論

洋蔥伯克氏菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中具有生物防治、生物降解以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種功能，有廣泛的應(yīng)用前景[26-27]。其可產(chǎn)生硝吡咯菌素、吩嗪、嗜鐵素、Cepaciamide A等多種次生代謝物質(zhì)[28-29]，硝吡咯菌素是可以阻斷病原菌呼吸鏈中脫氫酶和細(xì)胞色素之間電子傳遞。有研究表明洋蔥伯克氏菌還可產(chǎn)生降解水源污染物三氯乙烯的酶[30]。權(quán)春善等[31]從洋蔥伯克氏菌上清液中分離純化出對(duì)多種病原菌具有抑菌活性的環(huán)二肽。洋蔥伯克氏菌株AMMDR1[32]使豌豆種子細(xì)菌化后，腐霉菌游動(dòng)孢子對(duì)豌豆幼苗侵染率及卵孢子在根部定殖率大大降低，而產(chǎn)抗生素基因的缺失突變株不能抑制腐霉菌對(duì)豌豆的侵染，表明產(chǎn)生抗生素是Bcc菌株生物防治機(jī)制之一。Deng Peng等[33]從土壤中分離到菌株B. contaminans MS14，可抑制草坪褐斑病，并從菌株中分離純化到一種抗真菌糖肽Occidiofungin，該環(huán)狀糖肽化合物包含8 個(gè)氨基酸殘基，一個(gè)氨基酸上連接酰基和木糖，它可使真菌細(xì)胞內(nèi)部和形態(tài)發(fā)生畸變，且對(duì)多數(shù)病原真菌具有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)以灰葡萄孢霉為指示菌，對(duì)B. contaminans B-1抑菌物質(zhì)純化過(guò)程進(jìn)行抑菌活性追蹤，前期實(shí)驗(yàn)確定B-1發(fā)酵液的上清液無(wú)任何抑菌活性，菌懸液與發(fā)酵液的抑菌活性無(wú)顯著性差異，通過(guò)裂解菌體，從裂解液提取到有抑菌活性的蛋白，該抗菌物質(zhì)可能為一種胞內(nèi)蛋白，測(cè)得該蛋白分子質(zhì)量約為17.6 kDa，之前的文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道，故推測(cè)該抗菌蛋白可能為一種新蛋白。

基因組和蛋白組的發(fā)展促進(jìn)抗菌蛋白分子和基因工程的研究應(yīng)用，將來(lái)可通過(guò)對(duì)此抗菌蛋白進(jìn)行序列分析，克隆抗菌蛋白基因，構(gòu)建生防工程菌。因此以抗菌蛋白作為防治植物病害的新型生防因子具有巨大的應(yīng)用前景。