周晏陽，孔雪英，吳 梅，湯 承*

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

牦牛是青藏高原山脈附近的特有畜種，是牧民賴以生存的生產(chǎn)與生活資料[1]。由于牦牛制品如牦牛肉干、牦牛肉醬、牦牛酸奶和奶酪等天然、綠色、風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn)，受到了廣大消費(fèi)者的喜愛[2-3]。但牦牛制品中的食源性致病微生物問題卻不容忽視。胡萍等[4]報(bào)道天祝白牦牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為26.67%，牦牛肉干中金黃色葡萄球菌檢出率為14.70%；孔雪英等[5]也在新鮮牦牛肉中檢出了致病性沙門菌。肉制品與奶制品中的食源性致病微生物給牧民和消費(fèi)者健康帶來極大的風(fēng)險(xiǎn)。

乳酸菌普遍存在人與動(dòng)物體內(nèi)，是國際公認(rèn)食品級(jí)安全微生物[6]。乳酸菌不僅可以改善胃腸道微生態(tài)環(huán)境，還可以刺激黏膜和全身免疫，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高腸黏膜免疫等[7-9]。FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定益生菌篩選必須滿足3 個(gè)基本特點(diǎn)：耐受胃腸黏膜的選擇環(huán)境；黏附宿主的腸壁細(xì)胞；分泌物或者分解產(chǎn)物為抗菌物質(zhì)[10]。微生態(tài)制劑在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖尤其是養(yǎng)牛生產(chǎn)中的應(yīng)用還處于剛剛起步的階段，但專門針對(duì)牦牛的微生態(tài)制劑和食品添加劑還處于研究階段，并沒有商品化的產(chǎn)品[11-13]。本實(shí)驗(yàn)通過評(píng)價(jià)牦牛源產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌SWUN5815的益生性能，以期為牦牛源益生菌的開發(fā)提供新的菌種資源，為進(jìn)一步開發(fā)牦牛專用的微生態(tài)制劑以及食品添加劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌SWUN5815以及牦牛源大腸桿菌、牦牛源沙門菌、牦牛源金黃色葡萄球菌、牦牛源芽孢桿菌均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、藥敏片、MH（Muller-Hinton）培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；蛋白酶K、過氧化氫酶 美國Solarbio公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、DL 2000 DNA Marker大連寶生物公司；Caco-2細(xì)胞、胎牛血清 以色列BI公司；牛膽鹽 青島海博公司；分泌型免疫球蛋白A（SIgA）檢測(cè)試劑盒 武漢華美生物科技有限公司。

雌性清潔級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量16～18 g，購于成都達(dá)碩生物公司，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320PH酸度計(jì)、Biophotometer紫外分光光度計(jì)德國Eppendorf公司；Model 680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀美國Bio-Rad公司；牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm） 上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將實(shí)驗(yàn)室甘油保種的SWUN5815接種到MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳3 代確保SWUN5815活性良好。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

按照操作說明提取SWUN5815純化培養(yǎng)物的基因組DNA作為PCR模板，基于16S通用引物PCR擴(kuò)增得到16S rRNA基因序列并且構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將充分活化的菌株傳代培養(yǎng)后按照1%的量接入200 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，于不同時(shí)間取樣。每間隔2 h取1 次樣，測(cè)定樣本OD600nm值，并記錄數(shù)據(jù)，構(gòu)建生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 對(duì)牦牛常見腹瀉病原菌抑制的測(cè)定

選取牦牛源性致病病原菌沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及牦牛胃腸道分離的芽孢桿菌等13 株菌作為指示菌，參照文獻(xiàn)[14]測(cè)定植物乳桿菌SWUN5815細(xì)菌素的抑菌能力。

1.3.5 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)菌株的制備：大腸桿菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）質(zhì)控菌株種子液以1%接種于3 mL TSB培養(yǎng)基，180 r/min、37 ℃搖菌6 h；植物乳桿菌種子液以1%接種于4 mL MRS肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

用無菌棉拭子蘸取已經(jīng)校正的0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛鹊腟WUN5815菌液，均勻地涂布整個(gè)MH培養(yǎng)基表面。取藥敏紙片貼于平板表面，每個(gè)平板貼4 張紙片。每個(gè)平板各設(shè)3 個(gè)平行組。用大腸桿菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）作質(zhì)控菌株，37 ℃培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑[15]。

1.3.6 耐酸和耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

將植物乳桿菌菌株SWUN5815接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h后。將菌液調(diào)整pH值為2.0、3.0和終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%牛膽酸鹽，空白對(duì)照為相同時(shí)間的菌液。37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h后，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，并按式（1）計(jì)算細(xì)菌存活率，即可代表菌株對(duì)酸或者膽鹽的耐受性[16]。

1.3.7 SWUN5815對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 SWUN5815菌液準(zhǔn)備

將植物乳桿菌SWUN5815接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。分別將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的植物乳桿菌在5 000 r/min離心15 min。收集菌體后用無菌的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，最后重懸于無菌PBS中，調(diào)節(jié)細(xì)菌的濃度為1×108CFU/mL。

1.3.7.2 熒光標(biāo)記SWUN5815

將上述準(zhǔn)備好的植物乳桿菌SWUN5815懸浮于100 mg/mL異硫氰酸熒光素中，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗處作用1 h，再用無菌的PBS洗滌除去未結(jié)合的異硫氰酸熒光素，然后把細(xì)菌懸浮于無菌PBS中，調(diào)節(jié)其終濃度為1×108CFU/mL。

1.3.7.3 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)

Caco-2用無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，在細(xì)胞瓶中加入含10%的熱滅活胎牛血清和含100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素雙抗的DEME細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.7.4 黏附實(shí)驗(yàn)

1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液及1 mL熒光標(biāo)記的SWUN5815混勻，以不加菌的細(xì)胞為空白對(duì)照。培養(yǎng)板水平置于37 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，用無菌PBS將未黏附的菌洗脫。加入0.1 mL的胰酶細(xì)胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞懸液的熒光強(qiáng)度，發(fā)射光波長(zhǎng)為530 nm，吸收光波長(zhǎng)為485 nm，設(shè)置3 個(gè)平行對(duì)照[17]。細(xì)菌的黏附率計(jì)算如式（2）所示：

1.3.8 SWUN5815對(duì)小鼠體質(zhì)量影響的測(cè)定

經(jīng)1 周的適應(yīng)性飼喂后，將48 只小鼠隨機(jī)分為兩組，每組24 只。根據(jù)前期飼喂?jié)舛葘?duì)小鼠體質(zhì)量影響的結(jié)果，確定109CFU/mL為最佳的飼喂?jié)舛?。因此，?shí)驗(yàn)組小鼠灌胃飼喂0.5 mL植物乳桿菌（109CFU/mL），對(duì)照組小鼠灌服等量的MRS培養(yǎng)基，每天1 次，連續(xù)7 d；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均自由采食。在灌胃結(jié)束后的第1、7、14、21天對(duì)各組小鼠稱質(zhì)量，并記錄結(jié)果。

1.3.9 腸黏膜SIgA分泌的測(cè)定

每7 d稱質(zhì)量后每組隨機(jī)取3 只實(shí)驗(yàn)組與3 只對(duì)照組小鼠，刮取小腸黏膜加入等體積的PBS（pH 7.4）混勻，以6 000×g離心15 min，獲得上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎秒p抗夾心ELISA法測(cè)定采集樣本的SIgA含量，具體操作參照試劑盒使用說明書[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWUN5815株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征

圖1 SWUN5815照片（A）和顯微鏡圖（B）（×40）Fig.1 Colony morphology (A) and positive Gram-staining (B) of SWUN5815 (× 40)

如圖1所示，SWUN5815在MRS固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈圓形，顏色呈乳白色，表面光滑濕潤(rùn)，顯微鏡下呈短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色呈陽性。

2.2 SWUN5815 16S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

按照PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果顯示SWUN5815 16S rRNA基因擴(kuò)增片段大小約為1 500 bp，與預(yù)期片段大小相符（圖2）。根據(jù)16S rRNA序列測(cè)序結(jié)果，將其與GenBank中不同來源的植物乳桿菌相同區(qū)段基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖3可看出，11 株植物乳桿菌分為兩大支，SWUN5815與綿羊和山羊源的植物乳桿菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。

圖2 SWUN5815 16S rRNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electropherogram of PCR amplif i cation products of 16S rRNA sequence from SWUN5815

圖3 SWUN5815 16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SWUN5815 based on its 16S rRNA sequences

2.3 SWUN5815的生長(zhǎng)曲線

以SWUN5815的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，其OD600nm為縱坐標(biāo)。如圖4所示，SWUN5815菌株在0～2 h處于適應(yīng)期，2～12 h為對(duì)數(shù)期，大約到12 h達(dá)到生長(zhǎng)高峰，12～24 h為穩(wěn)定期，從該曲線上可以確定該菌體的最佳收獲時(shí)間是11 h。

圖4 植物乳桿菌SWUN5815菌株培養(yǎng)時(shí)間與OD600 nm的關(guān)系Fig.4 Relationship between culture time and OD600 nm value of SWUN5815

2.4 SWUN5815對(duì)牦牛源病原菌的抑制結(jié)果

由表1可知，SWUN5815所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)牦牛源腸道菌具有廣譜抑菌活性。

表1 SWUN5815對(duì)指示菌和牦牛源臨床分離株抑制效果Table1 Antimicrobial spectrum of bacteriocin produced by SWUN5815

2.5 SWUN5815抗生素敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)控菌株大腸桿菌（ATCC25922）和金葡球菌（ATCC25923）的抗藥性證明了結(jié)果的可靠性。根據(jù)美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)乳酸菌對(duì)多種藥物的敏感性。由表2可知，牦牛源植物乳桿菌SWUN5815對(duì)常用的9 種常用抗生素敏感。

表2 SWUN5815抗生素敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Antibiotic susceptibility of SWUN5815

2.6 SWUN5815耐酸和耐膽鹽能力

表3 SWUN5815對(duì)酸和膽鹽耐受結(jié)果Table3 Acid and bile salt tolerances of SWUN5815

如表3所示，SWUN5815對(duì)pH 2.0和pH 3.0的不同生長(zhǎng)環(huán)境表現(xiàn)出了不同程度的耐受性。在pH 2.0的環(huán)境下存活率為58.2%，在pH 3.0的環(huán)境下的存活率達(dá)到86.9%。SWUN5815在0.3%的牛膽酸鹽存在條件下培養(yǎng)3 h后，其對(duì)0.3%膽鹽的耐受率約為66.8%，說明其對(duì)膽鹽的耐受性較好。

2.7 SWUN5815對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附效果

將標(biāo)記好的SWUN5815與Caco-2細(xì)胞孵育結(jié)束后，計(jì)算得到SWUN5815對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率為42%。

2.8 SWUN5815對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表4 植物乳桿菌SWUN5815對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table4 Effects of L. plantarum SWUN5815 on body mass of mice g

由表4可知，在灌胃7、14、21 d后5×108CFU組平均質(zhì)量增加值均高于對(duì)照組。在灌胃7 d后5×108CFU組的平均體質(zhì)量已經(jīng)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），灌胃21 d，5×108CFU組小鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)合飼喂不同濃度植物乳桿菌SWUN5815的各時(shí)間段內(nèi)小鼠體質(zhì)量的變化結(jié)果表明，植物乳桿菌SWUN5815能夠顯著提高小鼠體質(zhì)量。

2.9 SWUN5815對(duì)小鼠小腸黏膜SIgA的影響

表5 植物乳桿菌SWUN5815對(duì)小鼠腸黏膜SIgA質(zhì)量濃度的影響Table5 Effects of L. plantarum SWUN5815 on SIgA concentration in mouse intestinal mucosa at different time points ng/mL

由表5可知，5×108CFU組的植物乳桿菌SWUN5815能夠極顯著提高SIgA的分泌（P＜0.01）。

3 討 論

SWUN5815對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有不同程度的抑制作用。已報(bào)道可以同時(shí)抑制革蘭氏陰性菌與陽性菌的乳酸菌并不多，如植物乳桿菌ZJ317、P158d等[19-20]。這可能是由于SWUN5815分泌不同類的細(xì)菌素造成的，集中細(xì)菌素協(xié)同發(fā)揮作用。細(xì)菌素的分泌量與外界環(huán)境有很大的關(guān)系，所以抑菌實(shí)驗(yàn)的時(shí)候環(huán)境要很穩(wěn)定。作為對(duì)人類和動(dòng)物的健康有益的活益生菌，乳酸菌必須滿足一些基本的要求，才能在胃腸道內(nèi)存活，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，發(fā)揮益生作用。對(duì)于反芻動(dòng)物而言，復(fù)胃消化是其重要的生理特點(diǎn)，小腸中高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽環(huán)境也不利于益生菌的存活，一般動(dòng)物的小腸內(nèi)膽鹽質(zhì)量濃度為0.3～3.0 g/L。乳酸菌需要耐受胃腸道的選擇性環(huán)境，所以胃腸道的特殊環(huán)境是篩選菌株的第一要素，這也是其能否在腸道定植發(fā)揮其益生功能的關(guān)鍵[21]。優(yōu)秀的乳酸菌必須能夠耐受胃腸道低pH值、膽鹽和酶類，并且在營(yíng)養(yǎng)學(xué)和免疫學(xué)上，可促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)[22]。黃堅(jiān)等[23]篩選的幾株優(yōu)秀耐久腸球菌在pH 3.0的環(huán)境下存活率最高達(dá)到84%，最低為62%，均低于SWUN5815；在0.3%的牛膽酸鹽條件下存活率最高73%，最低為52%，而SWUN5815的存活率為66.8%，與其相差不大。

通過研究植物乳桿菌SWUN5815的生物學(xué)特性表明，該分離株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，繁殖快，平臺(tái)期維持時(shí)間長(zhǎng)，因此十分適于大量發(fā)酵生產(chǎn)。該菌株耐酸和耐膽鹽能力突出，是其在消化道環(huán)境內(nèi)適應(yīng)存活的前提。SWUN5815對(duì)常見的多種抗生素均表現(xiàn)出敏感性，并且可以有效地抑制病原微生物的生長(zhǎng)，顯示出了其作為候選益生菌株的潛力。一些乳酸菌屬的益生菌株會(huì)對(duì)某些抗生素具有抗性，這可能與其攜帶的相關(guān)抗性基因有關(guān)，但這些抗性可能是內(nèi)源性或者天然性的，不一定具有轉(zhuǎn)移性。該菌株還能表達(dá)分泌細(xì)菌素，具有很好的抗微生物活性，因此在應(yīng)用時(shí)需要綜合考慮它們的表型及基因型特征與益生特性的關(guān)系。

檢測(cè)黏附性強(qiáng)弱是益生菌篩選過程中的首要指標(biāo)，因?yàn)檩^強(qiáng)的腸道黏附能力能讓乳酸菌在腸道停留更長(zhǎng)的時(shí)間，是后續(xù)發(fā)揮益生效應(yīng)的前提條件[24]。乳酸菌進(jìn)入消化道后，需要與腸道黏液中的蛋白受體進(jìn)行接觸附著后才能進(jìn)行定植和發(fā)揮作用，并且可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原菌與腸黏液的黏附，保護(hù)機(jī)體不受侵害[25-26]。細(xì)菌配體和特定的真核受體是細(xì)菌黏附的重要因素，因此人腸上皮樣細(xì)胞Caco-2是研究益生菌或病毒在腸道中黏附情形很好的模型。其中Caco-2細(xì)胞形態(tài)和功能與正常的小腸上皮細(xì)胞非常接近，比如含有腸道上皮細(xì)胞絨毛以及相應(yīng)的酶 ，因此被廣泛用于細(xì)菌黏附性、免疫調(diào)節(jié)、小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和新藥物的吸收情況等實(shí)驗(yàn)[27]。植物乳桿菌SWUN5815與Caco-2細(xì)胞可以很好地發(fā)生黏附，白潔等[16]研究表明植物乳桿菌的黏附率大于腸球菌、致病菌（K88）以及乳球菌，其植物乳桿菌的黏附率可以達(dá)到60%。林雪彥等[28]也報(bào)道乳酸桿菌對(duì)Caco-2有很好的黏附效果。乳酸菌為兼性厭氧菌，并且能夠形成生物膜，這也更利于其在腸道內(nèi)進(jìn)行快速定植并發(fā)揮作用[29]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明SWUN5815在灌胃7 d就可以顯著提高小鼠的腸黏膜免疫，前面實(shí)驗(yàn)證明了SWUN5815具有良好的黏附性能，而乳酸菌的黏附性是決定其免疫調(diào)節(jié)活性的關(guān)鍵因素。SWUN5815進(jìn)入到腸道后，可以黏附到腸上皮細(xì)胞，其菌體本身和代謝產(chǎn)物能夠刺激腸黏膜免疫系統(tǒng)，促進(jìn)SIgA的分泌。黏附性強(qiáng)的乳酸菌能延長(zhǎng)與宿主細(xì)胞的相互作用時(shí)間，從而更好地增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[30]。也有可能是SWUN5815通過合成分泌細(xì)菌素、抗氧化活性酶和降膽固醇相關(guān)酶來提升動(dòng)物的抗病能力[31]。

SWUN5815分離于牦牛腸道，具有種屬特異性，所以更適應(yīng)青藏高原的生態(tài)環(huán)境。并且其分泌的細(xì)菌素對(duì)牦牛體內(nèi)常見的病原菌均有良好的抑制作用，在牦牛奶制品和肉制品加工和貯藏過程中可以有效阻止微生物的污染，所以無論作為食品添加劑或者微生態(tài)制劑SWUN5815都是十分有潛力的優(yōu)良益生菌株。