林 洋，孫夢桐，呂欣然，白鳳翎,*，勵建榮，沈 琳

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；3.大連東霖食品股份有限公司，遼寧 大連 116101）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于淡水、海水、水量較為豐富的土壤和池塘等自然環(huán)境中。在養(yǎng)殖水體環(huán)境中，該屬細菌極易感染鯽魚、鯉魚和羅非魚等魚類，導(dǎo)致其皮膚潰瘍、魚鰭腐爛、眼球突起，也可引發(fā)水產(chǎn)動物出現(xiàn)敗血癥和人類的腹瀉病等[1-2]。嗜水氣單胞菌的致病性與其產(chǎn)生的溶血素、氣溶素、蛋白酶、脂肪酶、腸毒素、黏附素及外膜蛋白等毒力因子密切相關(guān)[3-5]。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）指細菌細胞間通過分泌信號分子進行相互交流，當信號分子濃度達到特定閾值時，細胞會啟動特定基因尤其是多種致病基因的表達[6]。隨著人們對QS系統(tǒng)深入了解，發(fā)現(xiàn)許多病原菌的致病性與其自身QS系統(tǒng)密切相關(guān)[7]。QS能夠參與致病菌毒力因子的表達、生物被膜的形成以及生物發(fā)光等現(xiàn)象。Khajanchi等[8]研究發(fā)現(xiàn)A. hydrophila SSU的QS系統(tǒng)中存在雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（QseBC），參與其生物被膜、胞外蛋白酶、群集和泳動的調(diào)控。楊安林等[9]發(fā)現(xiàn)外源信號分子AI-2能促進嗜水氣單胞菌聚集形成菌落，提高生物被膜的生成量，增強細菌耐藥性。Jahid等[10]認為嗜水氣單胞菌所產(chǎn)生的N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯（N-butanoy-l-L-homoserie lactone，C4-HSL）和N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-L-homoserie lactone，C6-HSL）均可參與其生物膜的形成和蛋白酶的產(chǎn)生，對QS系統(tǒng)具有調(diào)控作用。

群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitor，QSI）通常針對QS系統(tǒng)發(fā)揮抑制作用，且不干擾細菌體內(nèi)的正常生命活動[11]。QSI可通過阻斷QS傳導(dǎo)信號分子的合成、降解QS信號分子、降低或抑制信號分子受體蛋白活性以及菌群間競爭4 種方式發(fā)揮抑制作用[12]。生物源性QSI一般來源于動物、植物和微生物，微生物源性QSI主要來自于真菌和細菌的代謝產(chǎn)物。唐藝丹等[13]發(fā)現(xiàn)海洋真菌Penicillium sp. QF046代謝產(chǎn)物中存在對紫色桿菌QS具有抑制作用的星形曲霉毒素。Natrah等[14]研究發(fā)現(xiàn)微藻可有效降低A. hydrophila和A. salmonicida的毒力效應(yīng)，具有抑制QS活性的作用。

乳酸菌分布廣泛自然生態(tài)環(huán)境中，通過營養(yǎng)物競爭、生態(tài)位競爭、形成酸性環(huán)境以及產(chǎn)生拮抗性代謝產(chǎn)物等多種方式抑制他種微生物的生長繁殖[15]。乳酸菌生物制劑具有安全高效、綠色無殘留等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于各種食品領(lǐng)域。對于乳酸菌是否能夠通過影響QS系統(tǒng)的表達實現(xiàn)抑制食品腐敗菌和食源性致病菌的生長繁殖，其代謝產(chǎn)物中是否存在QSI，國內(nèi)外鮮見報道。Park等[16]從泡菜中分離到Lactobacillus sakei NR28，發(fā)現(xiàn)它能夠有效降低Escherichia coli ATCC43894 QS系統(tǒng)中AI-2的活性，從而抑制許多相關(guān)毒力因子的表達，具有QS抑制活性。

本實驗以水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌嗜水氣單胞菌為研究對象，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌中篩選能夠抑制嗜水氣單胞菌QS的菌株，并探究其對嗜水氣單胞菌蛋白酶、嗜鐵素等毒力因子及生物膜形成的影響，為研發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖乳酸菌微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件

乳酸菌菌株：分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜、芥菜、豆角、雪菜、黃瓜。

指示菌株：紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026，自身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類信號分子（N-acylhomoserine lactones，AHLs），僅當外源AHLs存在時，菌株可產(chǎn)生紫色菌素，可檢測C4-HSL～C8-HSL的信號分子，由本實驗室保藏。

目標菌株：嗜水氣單胞菌LY-2，分離自大菱鲆體表，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

MRS瓊脂、LB肉湯、LB瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乳酸菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司；甲醇（色譜級） 德國Merck公司；乙酸乙酯國藥集團化學(xué)試劑有限公司；卡那霉素、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA Marker-D、Taq聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master mix上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；Vortex GENIUS 3振蕩器 德國IKA公司；5804R高速冷凍離心機、ABI stepone plus PCR儀德國E p p e n d o r f公司；D Y Y-8 C電泳儀北京市六一儀器廠；Q u a n t i t y O n e凝膠成像系統(tǒng)、I m a r k酶標儀 美國B i o-R a d公司；MS105UD電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Free Zone 2.5臺式真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；S-4800掃描電鏡、E-1045鍍金儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌無細胞上清液（cell free supernatants，CFS）和嗜水氣單胞菌AHLs的制備

將初篩獲得的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，2.0%的接種量傳代培養(yǎng)2 次，37 ℃培養(yǎng)12 h。經(jīng)4 ℃、8 000 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜過濾獲得CFS，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

將-80 ℃保存的嗜水氣單胞菌接種于LB肉湯，30 ℃培養(yǎng)12 h，以1.0%的接種量傳代培養(yǎng)1 次后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，獲得的上清液中含有AHLs，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌QSI的篩選

濾紙片法：將180 μL的乳酸菌CFS分兩次浸濕于直徑為5 mm的圓形濾紙片上，無菌風(fēng)吹干，對照組為MRS，備用；紫色桿菌CV026過夜活化2 次后，以2%接入量接種于200 mL含有200 μg/mL卡那霉素的LB肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h，取2 mL紫色桿菌CV026與25 mL含有25 μL嗜水氣單胞菌AHLs的LB培養(yǎng)基混合，將濾紙片置于培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，記錄孔周圍出現(xiàn)的不透明的白色渾濁圈。

1.3.3 乳酸菌粗提物的制備

取100 mL乳酸菌CFS置于500 mL分液漏斗中，100 mL乙酸乙酯分5 次加入后沿同一方向緩慢振蕩靜置，待分層明顯后收集乳化層于三角瓶，將5 次萃取液合并后于45 ℃、120 r/min條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機溶劑氣味完全消失，將殘留液轉(zhuǎn)存至無菌錐形瓶，真空冷凍干燥制成粉末置于-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 乳酸菌粗提物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

采用液體倍比稀釋法[17]，將乳酸菌粗提物置于10 mL LB肉湯中制成終質(zhì)量濃度分別為2、4、8、16、32 mg/mL的溶液，以不加乳酸菌粗提物的LB肉湯為對照組，向每只試管中各加入濃度為106CFU/mL目標菌菌懸液180 μL，30 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，無渾濁現(xiàn)象的最小濃度為MIC，每組平行3 次。

1.3.5 乳酸菌粗提物對生物膜的影響

1.3.5.1 抑制率的測定

采用96 孔板法，96 孔板中每孔加入180 μL菌液，再加入20 μL粗提物，對照組MRS補平。30 ℃培養(yǎng)24 h后，移出孔內(nèi)培養(yǎng)液，用200 μL無菌水清洗3～5次，再添加200 μL 0.4%的結(jié)晶紫染色5 min，然后用無菌水清洗3 次，置于60 ℃恒溫干燥箱干燥10 min，取出96 孔板，在每個孔中加入200 μL 95%乙醇溶液，每個孔內(nèi)移出150 μL到另一96 孔板內(nèi)，用酶標儀在595 nm波長下測定OD值，每個樣品設(shè)置3 個平行。抑制率按式（1）計算：抑菌率/%＝OD對照-ODQSI×100（1）OD對照

式中：OD對照為嗜水氣單胞菌菌懸液OD值；ODQSI為粗提物處理組的OD值。

1.3.5.2 光學(xué)顯微鏡觀察

在24 孔板中放入無菌蓋玻片（R=1.4 cm），孔內(nèi)加入1 mL LB肉湯和10 μL過夜培養(yǎng)的目標菌菌液及100 μL QSI粗提物，30 ℃培養(yǎng)24 h后，再用超純水潤洗蓋玻片3次，0.4%結(jié)晶紫染色20 min，油鏡下觀察。

1.3.5.3 掃描電鏡分析

在24孔板中放入無菌蓋玻片（R=1.4 cm），孔內(nèi)加入1 mL LB肉湯和10 μL過夜培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌菌懸液及100 μL QSI粗提物，30 ℃培養(yǎng)24 h后，用超純水潤洗蓋玻片3 次，2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定過夜。用超純水洗滌3 次除去殘留的戊二醛，分別用40%、70%、90%、100%乙醇溶液進行脫水處理15 min，蓋玻片真空干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.3.6 胞外蛋白酶檢測

參考Sacherer等[18]的方法配制脫脂乳平板。將脫脂奶粉15%、瓊脂粉1.5%溶于蒸餾水中，105 ℃滅菌15 min。待測樣品分別為嗜水氣單胞菌菌懸液+AHLs、嗜水氣單胞菌菌懸液+MRS肉湯（0 mg/mL）、嗜水氣單胞菌菌懸液+乳酸菌粗提物（4 mg/mL）、嗜水氣單胞菌菌懸液+乳酸菌粗提物（8 mg/mL）。待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時，傾注平板，無菌風(fēng)吹干，采用雙層瓊脂擴散法[19]，測量水解圈的直徑，每組3 個平行，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.7 嗜鐵素的檢測

參照Shin等[20]的方法制作CAS（chrome azurol sulphonate）檢測平板。待測樣品分別為嗜水氣單胞菌菌懸液+AHLs、嗜水氣單胞菌菌懸液+MRS肉湯（0 mg/mL）、嗜水氣單胞菌菌懸液+乳酸菌粗提物（4 mg/mL）、嗜水氣單胞菌菌懸液+乳酸菌粗提物（8 mg/mL），待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時，傾注平板，無菌風(fēng)吹干。采用雙層瓊脂擴散法[19]，測量黃色暈圈直徑，每組3 個平行，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.8 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌群集和泳動運動的抑制

參照Packiavathy等[21]的方法并稍作修改，將不同質(zhì)量濃度乳酸菌粗提物經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾除菌后，分別與群集培養(yǎng)基（1%蛋白胨、0.5%瓊脂、0.5%氯化鈉及0.5%葡萄糖）和泳動培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨、0.3%瓊脂及0.5%氯化鈉）混勻倒板，使平板中乳酸菌粗提物的終質(zhì)量濃度達到0、2、4、8 mg/mL。向冷卻的平板中央加入5 μL嗜水氣單胞菌菌液，無菌風(fēng)吹干，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察嗜水氣單胞菌的遷移情況。遷移抑制率按式（2）計算：

式中：d對照為對照組嗜水氣單胞菌群集或泳動的遷移直徑/mm；dQSI為乳酸菌粗提物處理組嗜水氣單胞菌群集或泳動的遷移直徑/mm。

1.3.9 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs的降解

取10 μL AHLs粗提物加到終質(zhì)量濃度為0、4、8 mg/mL的QSI粗提物中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取2 mL紫色桿菌CV026與25 mL LB瓊脂混勻倒板，倒入底層鋪有素瓊脂的平板中，用牛津杯打孔，孔內(nèi)分別加入180 μL樣品，30 ℃培養(yǎng)24 h，記錄孔周圍出現(xiàn)紫色暈圈的直徑。

1.3.10 乳酸菌菌株鑒定

1.3.10.1 生理生化鑒定

挑選具有QS抑制作用的乳酸菌菌株，參照文獻[22-23]進行乳酸菌菌株生理生化鑒定。

1.3.10.2 16S rRNA鑒定

吸取1.0 m L乳酸菌菌株培養(yǎng)12 h的菌懸液加入1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min，采用D N A快速抽提試劑盒提取菌株D N A，以16S rDNA通用引物進行PCR擴增。正向引物為27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物為1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’），引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。PCR擴增反應(yīng)體系為DNA模板1.0 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL、dd H2O 9.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴增效果并照相。將擴增成功的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)校對后與NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫中的己有序列進行BLAST比對分析，運用MEGA 5.0軟件構(gòu)建乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用軟件Origin 8.0進行實驗數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)平行測定3 次，結(jié)果用 ±s表示，采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株QSI的篩選

利用濾紙片法從來自傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的135 株乳酸菌中獲得6 株對嗜水氣單胞菌QS有抑制作用的菌株，其中菌株SCT-2、AJS3-1、LHJ1-3對嗜水氣單胞菌QS抑制作用明顯，抑菌圈直徑分別為10.57、9.05 mm和8.79 mm（表1）。圖1為香草醛及3 株乳酸菌對紫色桿菌CV026產(chǎn)紫色素的抑制效果圖，可以看出菌株SCT-2的抑制QS效果明顯優(yōu)于香草醛。因此選擇菌株SCT-2進行后續(xù)實驗。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中乳酸菌對嗜水氣單胞菌QS的抑制作用Table1 Antagonistic QS effects of LAB from Chinese traditional fermented vegetables against A. hydrophila

圖1 香草醛（a）及乳酸菌（b）對紫色桿菌CV026產(chǎn)紫色素的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of vanillin and LAB on violacein production of C. violaceum CV026

2.2 乳酸菌粗提物的MIC測定結(jié)果

SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌和紫色桿菌CV026的抑菌情況如表2所示，肉眼觀察到嗜水氣單胞菌和紫色桿菌CV026試管中16 mg/mL及16 mg/mL以上均無渾濁現(xiàn)象，確定16 mg/mL為抑制嗜水氣單胞菌的MIC。為驗證菌株SCT-2是通過抑制嗜水氣單胞菌QS而不是抑菌的方式發(fā)揮作用，因而選擇8 mg/mL及以下質(zhì)量濃度的菌株SCT-2粗提物進行后續(xù)研究。

表2 菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌及紫色桿菌CV026的MIC Table2 MICs of SCT-2 against A. hydrophila and C. violaceum CV026

2.3 乳酸菌粗提物對生物膜形成的影響

生物膜指附著在實體表面的微生物群落，通過生長繁殖并分泌一些蛋白質(zhì)、DNA和多糖等，將細菌包裹其中組合成的胞外聚合物基體膜狀物[24]。96 孔板法結(jié)果表明，菌株SCT-2粗提物質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，對嗜水氣單胞菌生物膜的抑制率為45.16%。圖2是菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜影響的光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡圖片。光學(xué)顯微鏡圖片顯示，對照組嗜水氣單胞菌有濃密的細菌菌落而實驗組細菌菌落密度比較稀疏，結(jié)果表明菌株SCT-2粗提物能夠有效抑制嗜水氣單胞菌生物膜的形成（圖2A、B）。掃描電鏡圖片顯示，對照組嗜水氣單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)致密，而實驗組生物膜發(fā)生斷裂。說明菌株SCT-2粗提物不僅能夠降低嗜水氣單胞菌生物膜的生成量，而且可使其生物膜斷裂（圖2C、D）。

圖2 菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜形態(tài)的影響Fig.2 Effect of crude extract on biof i lm morphology of A. hydrophila

2.4 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌蛋白水解活性的影響

嗜水氣單胞菌的胞外蛋白酶能夠消化掉層片素和膠原等多種胞外組織基質(zhì)，使其變?yōu)榭晒C體利用的氨基酸，為病原菌的生長繁殖提供了良好的條件[25]。AHLs與菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌蛋白水解活性的影響如圖3所示，AHLs能夠使脫脂乳平板中水解圈直徑由（15.27±0.23）mm增大到（17.05±0.15）mm，兩者間具有顯著差異（P＜0.05）。此外，水解圈的大小隨著菌株SCT-2粗提物質(zhì)量濃度的增大而減小。由此看出，菌株SCT-2粗提物可顯著抑制嗜水氣單胞菌蛋白酶的產(chǎn)生（P＜0.05），降低其致病性，且4 mg/mL和8 mg/mL的菌株SCT-2粗提物對蛋白酶的抑制率分別達到12.05%和27.18%，結(jié)果表明，菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌蛋白酶的抑制作用與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

圖3 AHLs和乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌蛋白水解活性的影響Fig.3 Inhibitory activities of AHLs and crude extract from SCT-2 against proteolytic activity of A. hydrophila

2.5 嗜鐵素的檢測結(jié)果

嗜鐵素是指微生物在與Fe3+在低鐵應(yīng)激條件下形成的一種螯合因子，嗜水氣單胞菌通過產(chǎn)生嗜鐵素與環(huán)境中其他微生物競爭性結(jié)合Fe3+，影響其他微生物生長以維持自身菌群密度的穩(wěn)定[26-27]。由圖4可知，與0 mg/mL相比，AHLs處理組嗜鐵素的生成量顯著增大。結(jié)果表明QS對嗜水氣單胞菌嗜鐵素的產(chǎn)生存在調(diào)控作用。菌株SCT-2粗提物處理組的黃色圈明顯小于0 mg/mL，隨著菌株SCT-2粗提物質(zhì)量濃度的增大，黃色圈的直徑逐漸減小，且4 mg/mL和8 mg/mL的菌株SCT-2粗提物對嗜鐵素的抑制率分別達到14.59%和22.11%，說明菌株SCT-2粗提物能夠有效抑制嗜水氣單胞菌嗜鐵素的產(chǎn)生進而使其致病能力減弱。

圖4 AHLs和菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌嗜鐵素產(chǎn)生的影響Fig.4 Inhibitory activities of AHLs and crude extract from SCT-2 against siderophore production of A. hydrophila

2.6 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌群集和泳動現(xiàn)象抑制

群集和泳動都是由細菌鞭毛介導(dǎo)。群集是一種群體行為，微生物在可濕固體培養(yǎng)基表面或液體培養(yǎng)基內(nèi)運動。泳動是個體行為，微生物在固體培養(yǎng)基表面或半固體培養(yǎng)基上運動，產(chǎn)生可見生長圈的現(xiàn)象[28]。細菌的群集和泳動運動能力與細菌的侵襲能力有直接關(guān)系，對于病原細菌來說，抑制其運動性是重要的治病因素之一[29]。圖5是菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌群集和泳動的影響，隨著菌株SCT-2粗提物質(zhì)量濃度的增加，嗜水氣單胞菌遷移直徑均呈現(xiàn)增加下降趨勢，當菌株SCT-2粗提物質(zhì)量濃度為0 mg/mL時，嗜水氣單胞菌的群集和泳動的遷移直徑分別為（19.71±0.56）mm和（12.17±0.42）mm，群集培養(yǎng)基中8 mg/mL的菌株SCT-2粗提物可使嗜水氣單胞菌的遷移直徑降低為（9.05±0.87）mm，遷移抑制率達到54.08%。泳動培養(yǎng)基中4 mg/mL的菌株SCT-2粗提物可使嗜水氣單胞菌的遷移直徑降低為（7.52±0.63）mm，遷移抑制率達到38.21%，而8 mg/mL的乳酸菌粗提物使嗜水氣單胞菌的遷移完全受到抑制。

圖5 菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌群集（A）和泳動（B）的抑制作用Fig.5 Inhibitory activities of crude extract from SCT-2 on swarming (A)and swimming (B) of A. hydrophila

2.7 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌的信號分子的降解

圖6是乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌信號分子降解效果圖。與對照組相比，利用質(zhì)量濃度為4 mg/mL和8 mg/mL菌株SCT-2粗提物處理時，紫色暈圈變小且降解率分別達到12.14%和32.27%。結(jié)果表明，菌株SCT-2粗提物可降解嗜水氣單胞菌信號分子，從而抑制嗜水氣單胞菌的QS。Torres等[30]將分離自貝類的Alteromonas stellipolaris PQQ-42與C6-HSL（10 mmoL/L）共培養(yǎng)，降解率可達99.7%，進而抑制V. mediterranei VibC-Oc-097的QS現(xiàn)象，本研究與其結(jié)果相似。

圖6 菌株SCT-2粗提物降解AHLsFig.6 AHLs degradation by crude extract from SCT-2

2.8 乳酸菌菌株鑒定

菌株SCT-2的生理生化鑒定結(jié)果見表3，初步斷定菌株SCT-2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表3 菌株SCT-2的生理生化鑒定結(jié)果Table3 Physiological and biochemical characteristics of strain SCT-2

圖7 菌株SCT-2的16S rRNA基因擴增電泳圖Fig.7 PCR amplif i cation products of 16S rRNA gene from strain SCT-2

圖8 菌株SCT-2的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of strain SCT-2

圖7是菌株SCT-2的16S rRNA基因擴增電泳圖，可以看出菌株SCT-2核酸序列在1 400 bp左右出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標片段被成功擴增，擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將菌株測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖8可知，菌株SCT-2與L. plantarum KM577184.1在同一個分支上，置信度為100%，因此菌株SCT-2被鑒定為植物乳桿菌（L. plantarum），該結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果相同。

3 結(jié) 論

本研究從遼寧錦州酸菜中篩選出對嗜水氣單胞QS抑制效果較好的乳酸菌菌株SCT-2，應(yīng)用8 mg/mL菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜的抑制率為45.16%，光學(xué)顯微鏡下觀察進一步證明其能夠抑制細菌生物膜的形成，掃描電鏡分析表明菌株SCT-2粗提物不僅能夠降低嗜水氣單胞菌生物膜的生成量，而且使其生物膜發(fā)生斷裂。8 mg/mL的菌株SCT-2粗提物對嗜水氣單胞菌蛋白酶和嗜鐵素的抑制率分別達到27.18%和22.11%，且對嗜水氣單胞菌的群集和泳動現(xiàn)象抑制明顯；菌株SCT-2粗提物可通過降解信號分子實現(xiàn)QS抑制作用。經(jīng)生理生化和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌（L. plantarum）。