胡海寧，袁國強，何鴻建，梁志宏*

（中國農(nóng)業(yè)大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局統(tǒng)計，每年全球約有25%的食品被真菌毒素污染，年損失量約10億 t[1]。赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是青霉屬（Aspergillus sp.）和曲霉屬（Penicillium sp.）真菌產(chǎn)生的一種真菌毒素，廣泛分布于各類農(nóng)產(chǎn)品，如谷物、葡萄、咖啡豆、可可豆、堅果、香料和肉制品等[2]。在已發(fā)現(xiàn)的300多種真菌毒素中，OTA毒性僅次于黃曲霉毒素B1。已有研究表明，OTA對人和動物具有腎毒性、肝毒性、基因毒性、致突變性、致畸性和胚胎毒性等，并被國際癌癥研究機構確定為II B類致癌物[3]。為防治OTA，最佳措施是在作物收獲前后抑制真菌的生長繁殖和OTA的產(chǎn)生，但OTA的污染無法完全避免。生物脫毒方法能夠利用微生物或酶類的代謝活動或吸附作用將食品或飼料中殘留的真菌毒素含量降低至限量標準以下[4]。相較于物理脫毒和化學脫毒，生物脫毒具有專一性強、環(huán)境友好、效率高和較好地保持食品或飼料營養(yǎng)等優(yōu)勢。近年來，生物脫毒的基礎研究發(fā)展迅速，已有大量利用微生物脫除OTA的報道，包括絲狀真菌[5-6]、酵母菌[7-8]和細菌[9-10]等。

微生物主要通過兩種方式，即吸附作用和代謝活動，來脫除OTA。前者主要依靠微生物細胞壁對OTA的吸附作用，常見于酵母菌和乳酸菌[11-12]。而后者主要是依賴某些酶類將OTA轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。OTA的化學結(jié)構是一分子異香豆素部分（ochratoxin α，OTα）與一分子L-β-苯丙氨酸通過肽鍵連接。肽鍵的水解、內(nèi)酯環(huán)打開和羥基化是OTA主要的轉(zhuǎn)化途徑。OTα是肽鍵水解的產(chǎn)物，已有研究表明OTα對動物基本無毒，且在動物體內(nèi)的半衰期是OTA的十分之一[13]。OTA轉(zhuǎn)化為OTα的降解路徑在自然界的生物體內(nèi)廣泛分布，是動植物脫除OTA毒性的主要方式[14]。而內(nèi)酯環(huán)打開和羥基化反應相對較少見，且脫毒產(chǎn)物的毒性并沒有被闡明。

用于脫毒的微生物常以添加劑的形式加入到食品或動物飼料中，人和動物的胃腸道是其發(fā)揮脫毒作用的主要環(huán)境之一，因此脫毒微生物必須能耐受腸道環(huán)境并能在該環(huán)境下保持脫毒活性。腸道微生物在該方面具有先天優(yōu)勢，其對腸道環(huán)境具有良好的適應性，對腸道的潛在危害性較低，并且含有大量的有益菌，能夠為篩選適用于食品或飼料中的OTA脫毒菌株提供豐富資源。本實驗為定向篩選脫除OTA的菌株，先以添加一定量OTA的飼料飼喂小鼠，以收集的糞便為研究材料，再通過添加一定質(zhì)量濃度OTA的LB固體培養(yǎng)基逐步篩選，然后利用LB液體培養(yǎng)基進行二次篩選，并以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法評價菌株體外脫除OTA的能力，最后通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，以期篩選出能夠高效脫除OTA的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OTA（純度98%） 美國Sigma-Aldrich公司；BALB/c小鼠 北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

2690/2695型HPLC儀 美國Waters公司；DM2500光學顯微鏡 德國Leica公司；細菌DNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；ALD/1244 PCR儀美國Bio-Rad公司；3001酶標儀 芬蘭Thermo Fisher Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的初篩

以1 kg體質(zhì)量添加210 μg OTA[15]的飼料飼喂BALB/c小鼠90 d后，收集糞便，用無菌生理鹽水將糞便稀釋至10-1和10-2。初篩培養(yǎng)基采用雙層斜面平板結(jié)構，如圖1所示，將12 mL LB固體培養(yǎng)基傾注于平板底層形成一定角度的斜面，另將添加5 μg/L OTA的12 mL LB固體培養(yǎng)基傾注于平板上層。將糞便稀釋液均勻涂布在培養(yǎng)基上層，37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h。

圖1 初篩培養(yǎng)基的雙層斜面平板結(jié)構Fig.1 Double-deck slant medium for primary screening

將初篩培養(yǎng)基上生長的菌株轉(zhuǎn)接于10 mL含5 μg/L OTA的新鮮的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃避光培養(yǎng)24 h，再將生長的菌株繼續(xù)轉(zhuǎn)接于新鮮的LB固體培養(yǎng)基上，并將培養(yǎng)基中OTA質(zhì)量濃度依次提高至6 μg/L和10 μg/L。

1.3.2 菌株的復篩

選取在含10 μg/L OTA的LB固體培養(yǎng)基上生長的菌株，接種于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中。在200 r/min、37 ℃條件下，搖床過夜培養(yǎng)20 h。取0.5 mL發(fā)酵液于1 mL的離心管中，添加一定量的OTA使其終質(zhì)量濃度為25 μg/mL。以0.5 mL的LB液體培養(yǎng)基添加25 μg/mL的OTA作為對照組。將樣品和對照組于37 ℃、200 r/min的條件下，避光培養(yǎng)24 h。利用HPLC法測定OTA的剩余量。所有實驗重復3 次。

1.3.3 OTA的提取與定量

先用1 mol/L鹽酸將樣品的pH值調(diào)為2～3，再加入0.5 mL三氯甲烷，振蕩混勻后，4 ℃、6 000×g離心10 min，取三氯甲烷層，重復萃取2 次，將萃取液充分混合后用氮氣吹干，用1 mL無水甲醇復溶，經(jīng)0.22 μm的有機系微孔濾膜過濾后，用HPLC儀測定OTA的含量[16]。

HPLC系統(tǒng)所使用的色譜柱為C18Spherisorb S5 ODS2柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），配有熒光探測器；激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為333 nm和467 nm；流動相選擇乙腈-水-乙酸（99∶99∶2，V/V）；流速為1 mL/min；檢出限為0.02 ng；上樣量為20 μL。OTA脫除率的計算公式如下：

1.3.4 菌株的鑒定

1.3.4.1 形態(tài)鑒定

將菌株接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，并經(jīng)簡單染色法和革蘭氏染色法，在顯微鏡下觀察。

1.3.4.2 16S rDNA鑒定

使用細菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。以基因組DNA為模板，以8f/1492R[17]為引物，進行PCR擴增。PCR體系為30 μL，向離心管中依次加入3 μL 10×buffer，2.4 μL dNTPs，1.5 μL上游引物，1.5 μL下游引物，1 μL DNA模板，0.3 μL Taq酶，然后用無菌水補充至30 μL，稍加混合后立即進行PCR。PCR程序：95 ℃預變性5 min；進入循環(huán)：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃保溫7 min。取10 μL擴增產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物片段大小。PCR產(chǎn)物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中使用BLAST程序比對，并利用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（Neighbour-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 菌株生長條件的優(yōu)化

以菌液的OD600nm值作為評價指標，通過單因素優(yōu)化法，確定菌株生長的最適pH值、最適溫度和最適搖床速率。所有實驗重復3 次。菌株經(jīng)生長條件優(yōu)化后，測試體外OTA脫毒能力，方法同1.3.2節(jié)及1.3.3節(jié)。

1.3.5.1 最適生長pH值的確定

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16～18 h作為種子液，取3 mL種子液接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基，用1 mol/L氫氧化鈉溶液和1 mol/L鹽酸將pH值分別調(diào)至5.50、6.50、7.00、7.50和8.00。將培養(yǎng)基置于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)22～24 h。利用酶標儀測定菌液的OD600nm值。

1.3.5.2 最適生長溫度的確定

將新鮮的種子液接種于LB液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至1.3.5.1節(jié)確定的最適生長pH值，分別置于28、37、44 ℃的搖床，200 r/min培養(yǎng)22～24 h，其他條件同1.3.5.1節(jié)。測定菌液OD600nm值。

1.3.5.3 最適生長搖床速率的確定

將新鮮的種子液接種于LB液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至1.3.5.1節(jié)確定的最適生長pH值，并將培養(yǎng)基置于1.3.5.2節(jié)確定的最適生長溫度下，分別以150、200、230 r/min搖床培養(yǎng)22～24 h，其他條件同1.3.5.1節(jié)。測定菌液OD600nm值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果表示為±s（n=3），使用Prism 5.0軟件進行單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），并利用多重比較檢驗（Bonferroni’s multiple comparison test）進行顯著性差別分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩

小鼠腸道正常菌群受到多種因素的影響，包括小鼠品種、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料、個體差異和性別差異等因素。尹業(yè)師等[18]對影響小鼠腸道菌群的多種因素進行比較，發(fā)現(xiàn)小鼠在出生28 d后飼料和飼養(yǎng)環(huán)境是影響腸道菌群的主要因素，飼料的不同會導致腸道菌群有一定的波動，嚴重會造成菌群失調(diào)。

本實驗以1 kg體質(zhì)量添加210 μg OTA的飼料飼喂小鼠，研究已表明該劑量的OTA對小鼠健康的影響較小[15]。但在OTA的脅迫作用下部分腸道菌可能會發(fā)生變異，其中可能產(chǎn)生能夠脫毒的菌株。此外，腸道菌群中本身也可能存在脫除OTA的菌株。不同于其他報道的篩菌方法，本實驗的初篩培養(yǎng)基采用雙層斜面平板結(jié)構，OTA質(zhì)量濃度從一側(cè)到另一側(cè)梯度升高，該法能夠觀察到OTA質(zhì)量濃度對菌株生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株的生長隨OTA質(zhì)量濃度梯度同樣呈梯度變化，高質(zhì)量濃度區(qū)菌落數(shù)目明顯偏少。某些菌株雖然能夠耐受OTA，但在含OTA的培養(yǎng)基上生長繁殖會受到抑制，培養(yǎng)基中OTA的質(zhì)量濃度越高，抑制作用越明顯，但如果某些菌株能夠利用OTA作為碳源，其在含OTA的培養(yǎng)基上生長繁殖一般不會受到限制。初篩培養(yǎng)基后，再利用含一定質(zhì)量濃度OTA的LB固體培養(yǎng)基多次篩選，培養(yǎng)基中OTA質(zhì)量濃度依次提高，本實驗經(jīng)篩選共獲得12 株在OTA質(zhì)量濃度達到10 μg/L的培養(yǎng)基上依然能夠大量生長繁殖的菌株，依次編號為YH1～YH12，這些菌株極有可能具備脫除OTA的能力。

2.2 菌株的復篩

圖2 12 株初篩菌的OTA脫除率Fig.2 OTA detoxif i cation rates of 12 strains

以12 株初篩菌株體外脫除OTA，并以HPLC法檢測OTA的殘余量。如圖2所示，12 株菌均具有不同程度的OTA脫除效率，該結(jié)果證明本實驗采用的全新篩菌方法能夠從動物腸道中篩選出OTA脫毒菌株。菌株YH7的OTA脫除率顯著高于其他菌株，表明在該12 株菌中YH7的脫毒能力最強，OTA脫除率達84.6%（圖3）。菌株YH7被選取進行下一步的形態(tài)鑒定和16S rDNA鑒定。

圖3 菌株YH7的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of strain YH7

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)鑒定

菌株YH7的菌落形態(tài)為黃色，有光澤，菌落邊緣整齊，表面濕潤光滑，顯微鏡下細胞形態(tài)為細小短桿狀，革蘭氏染色呈陰性。

2.3.2 16S rDNA鑒定

在NCBI上使用BLAST進行16S rDNA序列比對，結(jié)果顯示菌株YH7序列與Escherichia coli O83:H1 NRG857C具有99%的序列同源性。結(jié)合如圖4所示的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可確定菌株YH7屬于大腸桿菌（E. coli）。

圖4 菌株YH7的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YH7

2.4 菌株生長條件的優(yōu)化

從圖5A可以看出，OD600nm值在pH 7.5左右達到最大，表明菌株YH7在中性和弱堿性條件下生長良好，該結(jié)果與預期相符；圖5B顯示OD600nm值在37 ℃處最大，表明菌株YH7更適合在37 ℃生長；從圖5C可看出，OD600nm值隨搖床速率的增加而增加，在搖床速率超過200 r/min時，OD600nm值不再顯著性變化，因此，菌株YH7的最適搖床速率確定為200 r/min左右。

圖5 不同培養(yǎng)條件下YH7菌液的OD600 nm值Fig.5 OD600 values of YH7 cultures under different conditions

菌株YH7是從小鼠糞便中分離出來的腸道菌。本實驗通過優(yōu)化得到的菌株YH7最適生長條件與腸道的環(huán)境條件非常接近，符合其作為腸道菌的特性。菌株YH7經(jīng)過生長條件優(yōu)化后，體外脫除OTA的能力得到顯著提高，脫除率達90.6%。

3 討 論

腸道微生物不僅對腸道環(huán)境具有良好的適應性，對動物腸道的潛在危害性較低，并且其中通常含有大量的益生菌。益生菌主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）的一些菌種和一些酵母菌（Saccharomyces）[19]。由于益生菌被普遍認為是安全的，在作為脫毒產(chǎn)品被相關管理部門如歐洲食品安全局批準進入市場前，無須經(jīng)歷嚴格而繁瑣的安全評價程序以證明其對人和動物的基本無害性[20]。除此之外，益生菌能夠分泌抗真菌物質(zhì)、轉(zhuǎn)化真菌毒素或真菌毒素的受體、增強動物胃腸道對病原體的免疫應答等[21-22]。因此，益生菌在食品或飼料脫毒領域中的應用具備先天優(yōu)勢。而動物腸道也成為脫毒微生物的理想來源。

目前已經(jīng)有一些涉及腸道微生物脫除OTA的報道。相對于單胃動物，反芻動物對包括OTA在內(nèi)的真菌毒素的抵抗力普遍較強[23]，原因被認為是反芻動物瘤胃中存在具有較高OTA降解能力的細菌，一些原生動物似乎也參與到OTA的降解中[24-25]。據(jù)報道，一種來源于瘤胃的溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）能夠脫除一定量的OTA[26]。除了反芻動物，人類、豬和小鼠的腸道內(nèi)也均發(fā)現(xiàn)具有OTA降解活性的微生物。Camel等[27]利用人腸道微生物在體外降解OTA，72 h后降解率最高達47%。一種厭氧菌被Upadhayaa等[28]從豬腸道內(nèi)分離，在體外固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，該菌在24 h后完全降解OTA。據(jù)Madhyastha等[29]的報道，鼠腸道微生物能夠?qū)TA水解為基本無毒的OTα，且大腸和盲腸是OTA水解的主要場所。雖然腸道微生物用于OTA脫毒的研究取得了一定的進展，但絕大多數(shù)報道未涉及脫毒微生物分離和鑒定。

本實驗從飼喂OTA的小鼠糞便中分離篩選出一株可以高效脫除OTA的革蘭氏陰性菌株YH7，經(jīng)鑒定確定為一種大腸桿菌，其脫毒能力達到了84.6%，并在pH 7.5、37 ℃、200 r/min搖床速率的培養(yǎng)條件下生長良好。該菌株對OTA的脫毒作用值得進一步研究，例如脫毒產(chǎn)物需要進行安全性評價，脫毒機理還需進一步闡明，以便該菌株能夠作為OTA脫毒產(chǎn)品應用于食品或飼料工業(yè)。

發(fā)展中國家的糧食安全形勢較發(fā)達國家更加嚴峻，脫毒技術必須緊跟人們對糧食安全日益增長的需求。生物脫毒技術憑借專一性強、環(huán)境友好、效率高和較好地保持食品或飼料營養(yǎng)等優(yōu)勢，迅速成為研究熱點。然而，目前對生物脫毒的研究存在諸多難題，主要有以下幾點：1）高效穩(wěn)定的脫毒菌株匱乏；2）菌株的脫毒機理尚不清晰，脫毒相關基因和活性成分有待進一步鑒定；3）對于菌株脫毒產(chǎn)物的安全性需要進一步評價；4）菌株脫毒條件的控制技術不夠成熟，離大規(guī)模生產(chǎn)應用還很遙遠。隨著研究的逐步深入，生物脫毒的理論基礎將進一步完善，脫毒技術也將進一步發(fā)展。相較于其他微生物中，腸道微生物在生物脫毒領域具有先天優(yōu)勢，包括對動物腸道具有更優(yōu)良的適應性、更低的潛在危害性和可能的益生功能，更加有利于食品或飼料工業(yè)中的應用和商業(yè)推廣，具有更加廣闊的發(fā)展前景。