王 健，徐曄曄，于 潔，高婷婷，王喜波*，江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）因其良好的功能性質(zhì)、營養(yǎng)價值及潛在的健康益處而成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)并被廣泛應(yīng)用于食品的多個領(lǐng)域[1-3]。蛋白質(zhì)的柔性可以理解為蛋白質(zhì)所處外部環(huán)境變化時，其結(jié)構(gòu)能夠發(fā)生改變的能力，反映出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對環(huán)境變化的敏感性[4-6]。因其在決定蛋白功能性質(zhì)尤其是界面性質(zhì)中的關(guān)鍵作用而受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。耿蕊等[7]研究發(fā)現(xiàn)pH偏移結(jié)合加熱處理在一定程度上改善了SPI的乳化性。Jiang Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SPI經(jīng)過酸性pH偏移處理后會形成“熔球態(tài)”的結(jié)構(gòu)，即在保持蛋白原有二級結(jié)構(gòu)不變的基礎(chǔ)上，其三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，在這種狀態(tài)下SPI的乳化能得到了顯著的提升。但目前鮮見從蛋白柔性的角度研究pH偏移結(jié)合熱處理對SPI結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)關(guān)系的影響的報道。

以SPI對胰蛋白酶的敏感性表征量化柔性，研究pH偏移結(jié)合熱處理對SPI柔性的影響，并探索SPI柔性與乳化性質(zhì)的相關(guān)性，為進(jìn)一步探索柔性在蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；大豆油 九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；三氯乙酸 永華精細(xì)化學(xué)品有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethan，Tris）、胰蛋白酶、8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid, azane, hydrate，ANS）熒光探針 美國Sigma公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18 Basic型高速分散機(jī)/勻漿機(jī) 德國IKA公司；LD4-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TU-1800型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；ALC-310.3型分析天平 德國艾科勒公司；UV2600紫外分光光度計 美國布魯克海文儀器公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；HH-6恒溫數(shù)顯水浴鍋常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；DSX-208B滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

參照Sorgentini等[9]的方法并略作改動。原料大豆用粉碎機(jī)粉碎后過60 目篩，索氏抽提，脫脂后的低溫脫脂豆粕與蒸餾水以質(zhì)量比1∶10的比例混合，調(diào)體系pH值至8.5，室溫低速攪拌2 h。離心（4 000×g）20 min，取上清液，調(diào)pH值至4.5，4 ℃靜置過夜，取沉淀進(jìn)行離心（4 000×g，5 min），水洗沉淀2 次，復(fù)溶后調(diào)pH值至7.0，預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.2 SPI成分測定

蛋白含量：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法測定；水分含量：參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》直接干燥法測定；灰分含量測定：參考GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗脂肪含量測定：參考GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》。

1.3.3 樣品前處理

將SPI溶于去離子水，質(zhì)量濃度為20 mg/mL，22 ℃攪拌2 h，10 000 r/min分散處理1 min，靜置12 h。

1.3.4 樣品處理

將制備好的樣品調(diào)pH值分別為pH 2.0、pH 7.0和pH 11.0。溫度分別為90、120 ℃處理15 min，迅速冰水冷卻5 min后調(diào)pH值至7.0備用。

1.3.5 柔性測定

參照Kato等[10]的方法略作修改。利用SPI對胰蛋白酶的敏感性來表征柔性。取250 μL1 mg/mL（0.05 mol/L、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液）酶液加入到4 mL1 mg/mL處理后SPI蛋白溶液中（蛋白∶酶=16∶1），38 ℃保溫酶解5 min，酶解反應(yīng)結(jié)束后，加4 mL 5%三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取上清液測定其在波長280 nm吸光度，用吸光度A表征量化柔性。

1.3.6 濁度測定

參照Kurganov等[11]的方法并略作改動，將處理后的SPI樣品溶液稀釋至3 mg/mL，混合均勻后在波長400 nm處測定其吸光度，所得吸光度表示濁度，所有測定結(jié)果重復(fù)3 次。

1.3.7 游離巰基含量測定

參照Beveriger等[12]的方法并略作改動。取1 mL不同條件處理后SPI樣品（10 mg/mL）加入到5 mL的Tris-甘氨酸緩沖溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，然后加入20 μL DTNB試劑，振蕩混勻，在室溫條件下靜止反應(yīng)15 min，在波長412 nm處測定吸光度，以不加DTNB的溶液做空白調(diào)零。游離巰基濃度按公式（1）計算：

式中：A412nm為412 nm波長處的吸光度；C為固形物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋系數(shù)。

1.3.8 表面疏水性測定

參照Schmal等[13]方法并略作改動。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將SPI樣品溶液稀釋到樣品質(zhì)量濃度分別為0.1、0.05、0.0025 mg/mL和0.001 25 mg/mL，加入20 μL的ANS（8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）熒光探針，混勻后在室溫條件下避光15 min后測定SPI樣品的熒光強(qiáng)度，同時設(shè)定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，測得的熒光強(qiáng)度對蛋白溶液濃度作圖，選擇線性關(guān)系良好的回歸線的斜率作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.9 粒徑測定

將處理過后的SPI樣品用去離子水稀釋到1 mg/mL，在粒度測定儀上進(jìn)行粒度的測定，每個蛋白樣品檢測3次。

1.3.10 紫外掃描

參照Liang Hanni等[14]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋至0.2 mg/mL后進(jìn)行紫外掃描，掃描波長范圍190～500 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率0.2 nm，所有測定結(jié)果重復(fù)3 次。

1.3.11 內(nèi)源性色氨酸熒光光譜測定

參照Liu Yan等[15]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋到0.2 mg/mL進(jìn)行測定，同時設(shè)定激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm，電壓為700 mV進(jìn)行熒光光譜掃描，所有測定結(jié)果重復(fù)3 次。

1.3.12 乳化性測定

參照Tang等[16]的方法。將處理后的SPI蛋白樣品稀釋到2 mg/mL，處理后蛋白樣品與大豆油以體積比3∶1混合，分散機(jī)（10 000 r/min）處理1 min，迅速吸取底部乳液50 μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，在旋渦混合器上混合均勻。分別測定0 min和10 min吸光度，乳化活性用吸光度A0表示，乳化穩(wěn)定性按公式（2）計算：

式中：A0為0 min時測得的吸光度；A10為10 min時測得的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每次實(shí)驗(yàn)做3 次平行，結(jié)果以 ±s表示，數(shù)據(jù)間差異顯著性采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI的組成

表1 SPI的基本成分及含量Table1 Proximate composition of SPI

如表1所示，實(shí)驗(yàn)所制得的SPI蛋白質(zhì)、水分、灰分和粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（90.22±0.44）%、（3.24±0.67）%、（3.39±0.53）%和（0.47±0.06）%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI柔性影響

圖1 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI柔性的影響Fig.1 Eeffect of pH-shifting combined with heating treatment on flexibility of SPI

由圖1可知，在各個pH偏移處理?xiàng)l件下，SPI柔性隨著處理溫度的升高而增大，在處理溫度為90 ℃時，pH 2.0和pH 7.0偏移處理?xiàng)l件下柔性無顯著性差異，而pH 11.0處理?xiàng)l件下，柔性則顯著上升。處理溫度為120 ℃時，pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下SPI柔性最高，其次分別為pH 2.0和pH 7.0。pH 2.0和pH 11.0偏移處理結(jié)合熱處理促進(jìn)了SPI在加熱過程中柔性的增加，其中pH 11.0偏移處理結(jié)合熱處理對柔性影響更為強(qiáng)烈。單獨(dú)的pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導(dǎo)致柔性輕微的上升，已有研究表明酸堿度的變化可以引起SPI結(jié)構(gòu)的變化[17]，Ishino等[18]研究發(fā)現(xiàn)SPI溶液在pH值大于11.0的堿性條件下會發(fā)生蛋白構(gòu)象變化而變性。pH偏移結(jié)合熱處理能有效破壞SPI分子天然的剛性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致SPI柔性的增加。

2.3 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI表面疏水性影響

圖2 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI表面疏水性的影響Fig.2 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on surface hydrophobicity of SPI

SPI分子內(nèi)的疏水相互作用是維系其三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，它對蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用。由圖2可知，在各個pH偏移處理?xiàng)l件下，處理溫度為90 ℃時，SPI表面疏水性顯著上升，隨后當(dāng)處理溫度為120 ℃時，表面疏水性卻顯著降低。與其他處理?xiàng)l件相比，SPI在pH 7.0、90 ℃處理?xiàng)l件時表面疏水性最高，這與顧龍建等[19]的結(jié)果相似，研究發(fā)現(xiàn)90 ℃熱處理會導(dǎo)致SPI表面疏水性的增加。Wang Jinmei等[20]認(rèn)為SPI在90 ℃條件下進(jìn)行熱處理時可以導(dǎo)致SPI蛋白的變性，其結(jié)構(gòu)更加舒展，原來隱藏在分子內(nèi)層的疏水性基團(tuán)暴露出來，所以SPI表現(xiàn)出很高的表面疏水性。相反，在120 ℃處理SPI時，蛋白之間產(chǎn)生的過度疏水作用導(dǎo)致聚集體形成，從而導(dǎo)致SPI表面疏水性降低。

而單獨(dú)pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導(dǎo)致SPI表面疏水性的增加，其中pH 2.0偏移處理增加幅度更大，原因可能是酸堿偏移處理可以使SPI蛋白結(jié)構(gòu)舒展，蛋白不能完全恢復(fù)最初的天然狀態(tài)，從而暴露出分子內(nèi)部部分疏水性基團(tuán)，導(dǎo)致表面疏水性的增加。

2.4 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI游離巰基含量影響

圖3 不同pH結(jié)合熱處理對SPI游離巰基含量的影響Fig.3 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on the content of free sulfhydryl groups in SPI

有2 種情況會導(dǎo)致蛋白分子中游離巰基含量的改變，一種情況是蛋白由于外界作用導(dǎo)致結(jié)構(gòu)展開，原來在分子內(nèi)部巰基的暴露。另一種情況可能是蛋白亞基的解離導(dǎo)致二硫鍵斷裂從而生成新的游離巰基[18]。一般來說，游離巰基含量變化意味著蛋白結(jié)構(gòu)改變，由圖3可知，在pH 7.0條件下，熱處理溫度的上升會導(dǎo)致SPI游離巰基含量的上升，相反，在pH 2.0和pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下熱處理溫度的升高會導(dǎo)致SPI游離巰基含量的降低，可能的解釋是由于熱處理，SPI分子內(nèi)或分子間形成二硫鍵，同時還可能伴隨有氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而使得巰基含量下降[23]。而單獨(dú)pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導(dǎo)致SPI游離巰基含量的下降，這與耿蕊等[19]的研究一致。另外，Hwang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，酸處理能夠顯著降低大豆蛋白的二硫鍵，使巰基含量升高。在pH 7.0條件下游離巰基含量隨處理溫度的升高而增加，可能是由于熱處理導(dǎo)致二硫鍵的斷裂，而二硫鍵的斷裂，可能是造成pH 7.0條件下柔性上升的主要原因[25]。

在pH 2.0和pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，120 ℃熱處理使SPI蛋白擁有柔性更高的構(gòu)象，而表面疏水性和游離巰基含量卻下降，可能的解釋是由于120 ℃熱處理導(dǎo)致SPI發(fā)生疏水相互作用形成聚集體，此過程使部分游離巰基內(nèi)卷于聚集體內(nèi)部，而非形成新的二硫鍵，維持了蛋白的柔性構(gòu)象[20]。

2.5 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI濁度影響

圖4 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI濁度的影響Fig.4 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on turbidity of SPI

由圖4可知，在pH 7.0條件下，熱處理溫度的上升會導(dǎo)致SPI濁度的上升。在pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下，處理溫度為90 ℃時，SPI濁度達(dá)到最大，在120 ℃時又略有下降。在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，熱處理溫度的上升會導(dǎo)致SPI濁度的下降。在pH 7.0條件下，熱處理導(dǎo)致蛋白分子之間形成聚集體，故濁度上升。pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下濁度顯著增大的變化趨勢可能是由于在調(diào)pH值回7.0過程中，蛋白重新形成了較大的聚集體，導(dǎo)致體系中濁度增大。

在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，熱處理溫度的上升會導(dǎo)致SPI濁度顯著下降，可能是由于堿性條件下，SPI分子中亞基解離，這一點(diǎn)在粒度分析和內(nèi)源性色氨酸熒光光譜分析中得到了證實(shí)，而亞基的解離，可能是pH 11.0偏移結(jié)合熱處理使SPI柔性顯著上升的原因之一。

2.6 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI粒徑影響

圖5 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI粒徑的影響Fig.5 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on particle size of SPI

由圖5可知，在pH 7.0條件下，SPI粒徑會隨著處理溫度的升高而降低，這與濁度的結(jié)果相反。在pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下處理溫度為90 ℃會導(dǎo)致SPI粒徑的降低，而當(dāng)處理溫度為120 ℃時SPI粒徑明顯增大，表明120 ℃處理導(dǎo)致SPI分子間發(fā)生了聚集，導(dǎo)致較大聚集體的形成。在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，與pH 7.0未經(jīng)熱處理的條件相比，SPI粒徑明顯降低，表明在pH 11.0條件下SPI解離，蛋白粒子變小，這與體系濁度變化趨勢一致。在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，90 ℃熱處理會導(dǎo)致SPI粒徑的降低，而120 ℃熱處理則導(dǎo)致SPI粒徑略有增加，這可能是源于部分解聚的SPI蛋白質(zhì)分子重新生成新的聚集體導(dǎo)致SPI平均粒度增大。單獨(dú)pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導(dǎo)致SPI粒徑的降低。pH 11.0偏移處理結(jié)合熱處理造成SPI蛋白粒度的降低，表明SPI蛋白分子發(fā)生了解離，這可能是造成SPI柔性增加的原因之一。

2.7 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI內(nèi)源性色氨酸熒光光譜分析

圖6 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI內(nèi)源性色氨酸熒光光譜Fig.6 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on typical intrinsic emission fluorescence spectrum of SPI

由圖6可知，在pH 7.0條件下，SPI內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨著處理溫度的上升而減弱，在pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下，SPI內(nèi)源性熒光強(qiáng)度也隨著處理溫度的上升而減弱，但降低幅度比在pH 7.0條件下更大，推測可能是在pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下，由于聚集體的形成，發(fā)色基團(tuán)重新隱藏在SPI分子內(nèi)部導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低（2.5節(jié)和2.6節(jié)結(jié)果）。在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，90 ℃處理溫度會導(dǎo)致內(nèi)源性熒光強(qiáng)度增加，但在處理溫度為120 ℃時又略有下降。單獨(dú)pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導(dǎo)致SPI內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度增加。已有研究表明，蛋白在發(fā)生亞基解離的時候，內(nèi)源熒光掃描的最大吸收波長會向長波長的方向移動（紅移）[26]。由圖6可知，在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，SPI內(nèi)源熒光掃描的最大吸收波長向長波長方向明顯移動，這說明SPI在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下發(fā)生了亞基的解離，其中熱處理會促進(jìn)亞基的解離。

2.8 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI紫外掃描光譜分析

由圖7可知，在pH 7.0條件下，隨著處理溫度的上升，SPI紫外吸收強(qiáng)度也隨之上升，這與柔性的變化趨勢一致，紫外吸收強(qiáng)度的增加表明SPI分子內(nèi)部發(fā)色基團(tuán)暴露在外部，SPI結(jié)構(gòu)變得更加舒展。在pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下，未進(jìn)行熱處理的SPI紫外吸收強(qiáng)度明顯上升，表明單獨(dú)的pH 2.0偏移處理會造成SPI結(jié)構(gòu)的改變，熱處理為90 ℃和120 ℃時會導(dǎo)致pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下SPI紫外吸收強(qiáng)度的降低，推測可能是由于聚集體的形成（2.5節(jié)和2.6節(jié)結(jié)果）。聚集體的形成導(dǎo)致暴露在外部發(fā)色基團(tuán)重新隱藏在分子內(nèi)部。在pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，熱處理會造成SPI紫外吸收強(qiáng)度的降低，可能是由于濁度的降低從而導(dǎo)致紫外吸光度的降低。

圖7 不同pH偏移結(jié)合熱處理下SPI紫外圖譜Fig.7 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on UV spectrum of SPI

2.9 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI乳化活性和乳化穩(wěn)定性影響

圖8 不同pH偏移結(jié)合熱處理對SPI乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig.8 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of SPI

由圖8可知，在各個pH偏移處理?xiàng)l件下，SPI乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著處理溫度的升高而增加，pH 2.0和pH 11.0偏移處理結(jié)合熱處理有利于SPI乳化性質(zhì)（乳化活性和乳化穩(wěn)定性）的增加。這與柔性變化趨勢一致。pH偏移結(jié)合熱處理使蛋白分子逐漸展開，分子的形態(tài)由緊密的球型結(jié)構(gòu)向松散結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，蛋白具有更好的柔性，更加有利于蛋白吸附在油水界面上并展開[27-28]。Tang Chuanhe等[29]認(rèn)為柔性的增加有利于牛血清蛋白界面的初始吸附和隨后的結(jié)構(gòu)重排，從而增加了蛋白的乳化活性。Matsudomi等[30]研究發(fā)現(xiàn)，極端酸性pH偏移處理對SPI的結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)有顯著影響。Jiang Jiang等[8]也發(fā)現(xiàn)酸性pH偏移處理可引發(fā)SPI的結(jié)構(gòu)向熔球態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，造成其乳化性的改善。部分變性和/或展開的蛋白通常表現(xiàn)為蛋白柔性的增強(qiáng)（相對于天然蛋白），這將有利于它們的乳化性能的提高。

2.10 不同pH偏移結(jié)合熱處理?xiàng)l件下SPI柔性與乳化性的相關(guān)關(guān)系

圖 9 不同pH偏移結(jié)合熱處理?xiàng)l件下柔性與乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的關(guān)系Fig. 9 Relationships between flexibility and emulsifying activity (A) or emulsion stability (B) of SPI under different treatment conditions

如圖9所示，相關(guān)性分析指出，在各個處理?xiàng)l件下SPI柔性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.945和0.936。而相關(guān)性分析指出，各個pH偏移結(jié)合熱處理?xiàng)l件下SPI表面疏水性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別呈正相關(guān)關(guān)系和顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.823和0.912。

不同pH偏移處理?xiàng)l件下SPI結(jié)構(gòu)隨柔性的變化趨勢各不相同。pH 7.0條件下，蛋白柔性隨著熱處理溫度的升高而增加，SPI表面疏水性在熱處理溫度90 ℃時顯著升高，在120 ℃又明顯下降。pH 7.0條件下，只有游離巰基含量隨熱處理溫度的升高而上升，在此條件下SPI柔性的增加可能是由于SPI分子內(nèi)二硫鍵的斷裂造成的。pH 2.0偏移處理?xiàng)l件下隨著熱處理溫度的升高，柔性逐漸增加，SPI表面疏水性在90 ℃熱處理時顯著升高，在120 ℃時又明顯下降，游離巰基含量隨熱處理溫度升高而下降，處理溫度為90 ℃會導(dǎo)致SPI粒徑的降低，當(dāng)處理溫度為120 ℃時SPI粒徑明顯的增大。說明聚集體的形成不會導(dǎo)致柔性的降低，原因可能是維系聚集體剛性結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵與天然的SPI分子內(nèi)部的化學(xué)鍵相比，化學(xué)鍵（如疏水相互作用和新生成的二硫鍵）之間的結(jié)合力更加容易受到破壞，導(dǎo)致蛋白對外部環(huán)境變化更加的敏感，從而聚集體也表現(xiàn)出較好的柔性。pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下熱處理會造成柔性的增加，SPI表面疏水性在90 ℃熱處理時顯著升高，在120 ℃時又明顯下降。游離巰基濃度隨熱處理溫度升高而下降。熱處理90 ℃和120 ℃會導(dǎo)致SPI粒徑的降低，內(nèi)源性色氨酸熒光光譜的結(jié)果表明SPI亞基發(fā)生了解離。在此條件下SPI柔性的增加可能是由于SPI分子解離造成的。

3 結(jié) 論

在各個pH偏移處理?xiàng)l件下，SPI柔性隨著處理溫度的升高而增加。相比于pH 7.0條件，pH 2.0和pH 11.0偏移處理促進(jìn)了SPI在加熱過程中柔性的增加，其中pH 11.0條件下熱處理對柔性影響更加強(qiáng)烈。

pH 7.0條件下，游離巰基含量隨熱處理溫度的升高而增加，SPI柔性的增加與SPI內(nèi)二硫鍵的斷裂有關(guān)。pH 11.0偏移處理?xiàng)l件下，SPI在加熱過程中發(fā)生了解離，SPI柔性增加。紫外掃描、內(nèi)源性色氨酸熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)隨著柔性的增加，SPI結(jié)構(gòu)變的更加舒展。

在實(shí)驗(yàn)條件下，SPI柔性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.945和0.936。