高 陽(yáng) 劉 杰 王 蕾 張 煒 劉亞飛 齊先梅 王 望，3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069；3.北京市呼吸和肺循環(huán)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100020)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension， PAH)是一種以肺小動(dòng)脈異常收縮以及重構(gòu)為病理特征的一組臨床綜合征，最終導(dǎo)致右心室衰竭甚至死亡[1-2]。PAH的病理機(jī)制為肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，功能紊亂，致使內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞異常增生，甚至形成新生內(nèi)膜、叢狀壞死區(qū)[2-4]。至今，肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，可靠的動(dòng)物模型有助于其研究。目前制備肺動(dòng)脈高壓的動(dòng)物模型有外科手術(shù)建立分流術(shù)、野百合堿注射、低氧誘導(dǎo)等方法[5]，但這些模型尚不能完全模擬肺動(dòng)脈高壓患者的肺血管病變[6]。因此，為了深入研究肺動(dòng)脈高壓病理生理特點(diǎn)及其發(fā)病機(jī)制，建立切合臨床發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀葹橹匾?/p>

目前，單純低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，是肺動(dòng)脈高壓研究中應(yīng)用廣泛的模型之一，源于其良好的重現(xiàn)性和易于描述的組織病理學(xué)特點(diǎn)[5，7]。該動(dòng)物模型，主要通過(guò)低氧條件刺激肺小動(dòng)脈中膜平滑肌增生，血管基質(zhì)沉積，引起一系列病理改變[8]，接近肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的自然病理過(guò)程[9]。但是，肺動(dòng)脈高壓病因十分復(fù)雜，這種造模方法并不能完全模擬人類肺動(dòng)脈高壓的病理特征。因此急需一種更理想的造模方法來(lái)模擬人類肺動(dòng)脈高壓[1]。

SU5416{Z-3[(2，4-二甲基吡硌-5-羥基)亞甲基]-2-吲哚滿酮}，是一種脂溶性小分子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑[8]，能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(VEGFR-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)，造成內(nèi)皮細(xì)胞死亡[10]。已有研究[11-16]表明：低氧聯(lián)合SU5416誘導(dǎo)大鼠，能夠較好地模擬肺血管新生內(nèi)膜和叢狀病變。其機(jī)制可能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和低氧刺激有關(guān)。VEGF維持肺血管內(nèi)皮細(xì)胞存活[17]，SU5416通過(guò)抑制VEGFR干擾VEGF發(fā)揮作用，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，啟動(dòng)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)，繼而激活細(xì)胞內(nèi)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)過(guò)度表達(dá)，使肺血管壁內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡性，形成凋亡抵抗?fàn)顟B(tài)[8]。在低氧環(huán)境持續(xù)刺激下，致使具有抗凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增生，參與肺血管重構(gòu)，進(jìn)而形成肺動(dòng)脈高壓[18]。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用低氧聯(lián)合SU5416建立肺動(dòng)脈高壓小鼠模型，且與單純低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型進(jìn)行比較并分析，探索低氧聯(lián)合SU5416能否建立更顯著的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型，更大程度模擬肺動(dòng)脈高壓患者的臨床病理生理特點(diǎn)，為低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的闡明和治療靶點(diǎn)的研究提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有助于肺動(dòng)脈高壓的深入研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取15只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011]，體質(zhì)量18～25 g，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組(每組5只)：常氧組、單純低氧組、低氧聯(lián)合SU5416組。肺動(dòng)脈高壓小鼠模型建立，如圖1，低氧組小鼠置于常壓低氧箱內(nèi)，氧氣濃度10%(體積分?jǐn)?shù))，每天持續(xù)低氧，共計(jì)4周，每周更換墊料、水、食物3次；低氧聯(lián)合SU5416組，將SU5416溶于溶劑DMSO中，給予SU5416(20 mg/kg)腹腔注射，每周2次；單純低氧組，與低氧聯(lián)合SU5416組同一時(shí)間點(diǎn)給予同等劑量DMSO腹腔注射；常氧組，置于同一房間內(nèi)，常壓常氧環(huán)境飼養(yǎng)4周，飼養(yǎng)條件保持基本相同。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案Fig.1 Experimental setup

Male C57BL/6 mice were injected subcutaneously twice a week with SU5416 (20 mg/kg) or DMSO combined with exposure to hypoxic environment for four weeks. Normoxia was used as control.

1.2 主要試劑及系統(tǒng)

SU5416購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(將SU5416溶于DMSO溶液，調(diào)整其終濃度為4g/L)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)右心室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)和右心室/體質(zhì)量比值的檢測(cè)：在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4周后，稱量各組小鼠體質(zhì)量(body weight， BW)，將各組實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉，采用閉胸右心室穿刺法檢測(cè)其右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure， RVSP)。隨后分離出小鼠心臟，剪去心耳，再沿室間隔剪下右心室，用濾紙吸去其水分，分別稱量右心室(right ventricle， RV)、左心室+室間隔(left ventricle plus interventricular septum， LV+S)的質(zhì)量，最后計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(the index of right ventricular hypertrophy， RVHI=RV/(LV+S)×100%)和右心室/體質(zhì)量比值(right ventricle/body weight， RV/BW)。

2)肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察：將各實(shí)驗(yàn)組小鼠分離出左肺組織，利用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液沖洗干凈，再固定于4%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液中，然后依次進(jìn)行梯度乙醇脫水，石蠟包埋，做4 μm/張的連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，最后在光鏡(200×)下觀察肺小動(dòng)脈變化，并利用NIS-Elements顯微圖像處理軟件測(cè)量各小組動(dòng)物肺小動(dòng)脈(直徑為0～100 μm)管壁的血管外周長(zhǎng)(中膜以內(nèi))和血管腔周長(zhǎng)(內(nèi)膜表面以內(nèi))，計(jì)算血管壁中膜厚度占血管外徑百分比(medial thickness， MT%)，依據(jù)公式[19]：①中膜厚度=血管外周長(zhǎng)/2π-血管腔周長(zhǎng)/2π；②MT%=(中膜厚度×2)/(血管外周長(zhǎng)/π)×100%；計(jì)算肺小動(dòng)脈血管內(nèi)徑(vessel diameter， VD)、血管外徑(external diameter， ED)和MT%(MT%= (ED-VD)/ED×100%)，按照ED分為0～5 μm、26～50 μm、51～75 μm、76～100 μm 4組，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩種造模方法中小鼠體質(zhì)量的變化

如表1所示，0周時(shí)，各組小鼠體質(zhì)量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從0周到4周，3組小鼠體質(zhì)量均隨時(shí)間增加而增加(P<0.05)。4周時(shí)，單純低氧組和低氧聯(lián)合SU5416組，與常氧組相比，其體質(zhì)量低于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但低氧聯(lián)合SU5416組與單純低氧組體質(zhì)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常環(huán)境飼養(yǎng)的小鼠相比，低氧環(huán)境中小鼠體質(zhì)量有明顯減輕。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of mouse body weightamong three groups

**P<0.01vsnormoxia (4 weeks);n=5.

2.2 兩種造模方法中RVSP、RVHI、RV/BW的比較

4周時(shí)，常氧組小鼠RVSP為(20.14±1.19)mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，單純低氧組高達(dá)(25.46±0.89)mmHg，比常氧組高(26.42±7.99)% (P<0.01)，而低氧聯(lián)合SU5416組更是達(dá)到(29.94±1.14)mmHg，與單純低氧組相比，高于該組(17.59±11.43)% (P<0.05)。低氧聯(lián)合SU5416小鼠的RVSP顯著高于單純低氧組，建立肺動(dòng)脈壓力更高的小鼠模型(圖2A)。

圖2 各組小鼠RVSP、RVHI及RV/BW 的比較Fig.2 Comparison of RVSP，RVHI，RV/BW among three groups

*P<0.05;**P<0.01 ；***P<0.001;n=5;△1 mmHg=0.133kPa；A: RVSP;B: RVHI;C: RV/BW;RVSP: right ventricular systolic pressure;RVHI: index of right ventricular hypertrophy;RV/BW: right ventricular/body weight.

本實(shí)驗(yàn)用RVHI和RV/BW反映小鼠右心室肥厚程度。4周時(shí)，常氧組小鼠RVHI為(19.00±0.54)%，單純低氧組小鼠RVHI增長(zhǎng)到了(23.32±1.77)%，高于常氧組(22.73±17.19)%(P<0.05)。低氧聯(lián)合SU5416組更是達(dá)到了(30.23±0.58)%，與單純低氧組相比，該組小鼠的RVHI增長(zhǎng)(29.63±5.80)% (P<0.01)(圖2B)。

4周時(shí)，常氧組小鼠的RV/BW為(7.37±0.15)%，單純低氧組為(8.95±0.54)%，低氧聯(lián)合SU5416組達(dá)到(9.96±0.10)%，各組之間進(jìn)行比較：?jiǎn)渭兊脱踅M小鼠RV/BW較常氧組高(21.37±12.95)% (P<0.05)。低氧聯(lián)合SU5416組小鼠RV/BW更是高于常氧組(35.15±3.94)%(P<0.001)。而低氧聯(lián)合SU5416組小鼠的RV/BW與單純低氧組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2C)。低氧聯(lián)合SU5416小鼠的右心室比單純低氧組小鼠的右心室肥厚更加顯著。

2.3 兩種造模方法中肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)比較

肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)主要發(fā)生于肺小動(dòng)脈血管壁中膜，故本實(shí)驗(yàn)用血管壁中膜厚度占血管外徑百分比(MT%)作為衡量肺血管重構(gòu)的指標(biāo)。4周時(shí)，常氧組小鼠肺小動(dòng)脈管壁薄，結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)和管腔正常；單純低氧組小鼠肺小動(dòng)脈管壁較常氧組明顯增厚，且管腔變狹窄；與單純低氧組相比，低氧聯(lián)合SU5416組小鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚程度更加嚴(yán)重，管腔變得更為狹窄(圖3)。

圖3 各組小鼠肺組織HE染色Fig.3 Sections of the lungs were stained with HE staining

Medial wall thickness of small pulmonary arteries in three groups.Scalebar: 50 μm. The frame indicates distal pulmonary arteries.

根據(jù)各組小鼠肺小動(dòng)脈血管外徑大小，將其分為4組，依次為0～25 μm，26～50 μm， 51～75 μm， 76～100 μm， 通過(guò)檢測(cè)各個(gè)級(jí)別血管的中膜厚度百分比，得出常氧組的MT%依次為(22.77±1.35)%、(21.63±1.13)%、(15.86±0.81)%、(16.45±1.08)%；而單純低氧組MT%更高，依次達(dá)到(35.92±2.11)%、(27.33±0.55)%、(22.94±1.03)%、(17.29±0.91)%，且在外徑分為0～25 μm， 26～50 μm， 51～75 μm三個(gè)級(jí)別肺動(dòng)脈血管中，顯著高于常氧組；與單純低氧組MT%相比，低氧聯(lián)合SU5416組在4個(gè)級(jí)別肺血管MT%均顯著增加，更是達(dá)到(44.08±1.64)%、(36.59±1.41)%、(25.70±0.85)%、(20.80±1.37)%(圖4)。通過(guò)肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的比較得出，低氧聯(lián)合SU5416組的肺小血管重構(gòu)比單純低氧組更嚴(yán)重。

3 討論

圖4 各組小鼠MT%的比較Fig.4 Comparison of MT% of smallpulmonary arteries among different groups

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;n=15-20/group;MT: media thickness.

本實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為常氧組、單純低氧組以及低氧聯(lián)合SU5416組，進(jìn)行4周實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示低氧聯(lián)合SU5416組表現(xiàn)出顯著的肺動(dòng)脈高壓特點(diǎn)：低氧聯(lián)合SU5416組的RVSP、RVHI、MT%均高于單純低氧組，且其肺小血管較單純低氧組重構(gòu)更明顯，管腔更狹窄。此造模方法比單純低氧誘導(dǎo)方法建立更為顯著的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型。

單純低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型，最主要的病理生理特點(diǎn)是肺血管收縮和重構(gòu)。在低氧環(huán)境刺激下，肺小動(dòng)脈血管持續(xù)性反復(fù)收縮，導(dǎo)致肺血管發(fā)生重構(gòu)，使得各級(jí)肺血管管壁增厚和超微結(jié)構(gòu)改變，肺循環(huán)外周阻力增加，肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高，致使右心室肥厚，惡性循環(huán)形成肺動(dòng)脈高壓[20-21]。所以該動(dòng)物模型能夠模擬一般肺動(dòng)脈高壓患者的病理特征。

低氧聯(lián)合SU5416模型，VEGF維持肺血管內(nèi)皮細(xì)胞正常生理功能，SU5416通過(guò)抑制VEGFR，破壞肺血管內(nèi)皮細(xì)胞正常生理，使得Caspase-3上調(diào)，Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，可致使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡性死亡，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2過(guò)度表達(dá)，該基因是一種原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其使肺血管壁內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡性，形成凋亡抵抗?fàn)顟B(tài)，產(chǎn)生抗凋亡性的內(nèi)皮細(xì)胞，在低氧環(huán)境刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞異常增生。平滑肌細(xì)胞，也因受低氧刺激，其內(nèi)活性氧水平升高，激活缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)基因轉(zhuǎn)錄和上游基因表達(dá)，促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而使VEGF轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF和其受體表達(dá)增加[8]。同時(shí)引起肺小血管處募集炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)促炎性反應(yīng)因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6 receptor，IL-6)大量表達(dá)，也刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生，上調(diào)血管平滑肌VEGFR-2，內(nèi)皮細(xì)胞大量產(chǎn)生內(nèi)皮素-1(endothelin-1， ET-1)，且平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素受體A(ETRA)增加，進(jìn)而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生，形成肺部小血管病變，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。

低氧聯(lián)合SU5416造模方法，近年來(lái)應(yīng)用于肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的研究，在大鼠造模方面有明顯效果。研究[16]表明，單次注射，低氧環(huán)境3周可以建立顯著的肺動(dòng)脈高壓模型，甚至模擬出人類嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓特征即叢狀病變[22]。但此模型在小鼠上未達(dá)成共識(shí)。有研究者[23]在SV129小鼠上成功建立起重度肺動(dòng)脈高壓模型，模擬出臨床重度肺動(dòng)脈高壓特點(diǎn)：新生內(nèi)膜、叢狀病變、募集巨噬細(xì)胞、肺小動(dòng)脈肌化。也有研究者[24]成功用C57BL/6小鼠建立嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓模型，但亦有研究者[10，25]未能建立該模型。據(jù)此推測(cè)，可能是不同種系小鼠對(duì)低氧、SU5416的影響和反應(yīng)程度不同，導(dǎo)致肺部病變發(fā)展速度不同。C57BL/6小鼠可能對(duì)低氧聯(lián)合SU5416誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓有較高的抵抗力。

本實(shí)驗(yàn)選擇C57BL/6小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該品系是實(shí)驗(yàn)研究中的常用小鼠。鑒于以前的研究[10]，小鼠一般在低氧環(huán)境[9%～10%(體積分?jǐn)?shù))氧氣]飼養(yǎng)3周，最多每只小鼠注射SU5416(20 mg/kg)達(dá)到6次，在本實(shí)驗(yàn)中，延長(zhǎng)低氧時(shí)間，達(dá)到4周，并保持SU5416(20 mg/kg)注射頻率，處死前，每只小鼠達(dá)到了注射該試劑8次，以達(dá)到成功模擬更為顯著的肺動(dòng)脈高壓，甚至嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓的目的。

總之，低氧聯(lián)合SU5416處理C57BL/6小鼠，能夠模擬出更為顯著的肺動(dòng)脈高壓模型。但該模型能否模擬出嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓，本實(shí)驗(yàn)無(wú)從判斷。雖然未在HE染色的肺小血管中觀察到明顯的叢狀病變，但筆者未利用雙熒光染色、免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)肺小血管新生內(nèi)膜狀況、血管壁肌化程度等嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓病變特點(diǎn)。也有可能與SU5416注射頻率、注射劑量不足有關(guān)。這有待于后續(xù)研究，才能判斷低氧聯(lián)合SU5416能否在C57BL/6品系小鼠上建立嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓模型。