曹丹丹 孫 靜 白云飛 王 苗 郭晨佳 崔 靜 李 良

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系，北京 100069)

慢性腦血流低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 和血管性癡呆的重要發(fā)病危險因素，動脈硬化、心輸出量減少、血壓過高或過低等都是造成CCH的原因。CCH使腦組織能量代謝障礙，引起神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和白質(zhì)病變，從而引起認(rèn)知功能障礙[1]。血-腦脊液屏障(blood brain barrier, BBB)是腦組織與血液之間的物質(zhì)交換屏障結(jié)構(gòu)，具有調(diào)節(jié)血液中營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、各種電解質(zhì)出入腦組織，維持神經(jīng)系統(tǒng)正常內(nèi)環(huán)境的作用。BBB損傷可引起有毒物質(zhì)聚集、炎性細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞遷移至腦實質(zhì)，引起腦組織炎性反應(yīng)等一系列損傷。周細(xì)胞是BBB的重要組成成分之一，對于血管形成、控制腦血流量、維持BBB功能等都發(fā)揮著重要作用[2]。近些年來，周細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用逐漸引起人們的重視，而其在CCH時的變化尚未見報道。大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(two-vessel occlusion, 2-VO)模型是目前國內(nèi)外公認(rèn)的能夠模擬人類CCH的動物模型[3-4]。本研究擬采用2-VO大鼠模型，探討周細(xì)胞在腦低灌注BBB損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠CD31抗體 (谷歌生物公司); 小鼠PDGFRβ抗體 (美國Abcam公司)；FITC標(biāo)記兔抗人纖維蛋白(原)抗體 (北京中杉金橋公司)；小鼠四型膠原抗體、人纖維蛋白原、CCK-8細(xì)胞活性試劑盒購于美國Sigma公司；Alexa Fluor 488/594 山羊抗小鼠IgG購于美國Invitrogen公司。

石蠟包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國Leica公司)；熒光顯微鏡(德國Leica 公司);小動物磁共振成像設(shè)備(德國Bruker 公司)；透射電子顯微鏡(日本日立公司HT7700)。

1.2 動物與分組

12周齡雄性Wistar大鼠，SPF級，購自北京維通利華動物供應(yīng)中心，實驗動物合格證號：SCXK京2002-0003。將大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組: 對照組、3 d模型組、14 d模型組和30 d模型組，每組動物12只。

1.3 2-VO動物模型的制備

10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛3×10-3mL/g腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，行頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，模型組用絲線行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎[4]；對照組只做雙側(cè)頸總動脈分離不結(jié)扎，縫合切口。

1.4 腦血流量檢測

應(yīng)用7.0T磁共振動脈自旋標(biāo)記( arterial spin labeling, ASL) 技術(shù)測定大鼠腦血流量(cerebral blood flow, CBF)[5]。使用 Pharma Scan 7.0/ 16US 磁共振成像系統(tǒng)，對所有大鼠行常規(guī)ASL序列掃描，選取感興趣區(qū)，測量雙側(cè)頂葉深部皮質(zhì)CBF值。

1.5 免疫組織熒光染色

大鼠灌注固定后行連續(xù)冠狀位切片，厚25μm，根據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜選取相同部位的冠狀切面進(jìn)行染色，一抗4 ℃過夜；二抗室溫避光孵育，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 大鼠腦周細(xì)胞原代培養(yǎng)

依照文獻(xiàn)[6]報道的方法分離腦微血管段，用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至第10天后，胰酶消化、傳代。體外實驗采用3～10代周細(xì)胞。

1.7 CCK-8檢測細(xì)胞增生活力

原代培養(yǎng)周細(xì)胞每孔5 000個接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后分別加入不同濃度纖維蛋白原，培養(yǎng)24 h后每孔加CCK8試劑10 μL，溫育2 h后450 nm處測定吸光度(A) 值。實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

1.8 電鏡檢測

動物處死后快速取下頂葉深部皮質(zhì)，經(jīng)固定、脫水、包埋、固化后，超薄切片機(jī)切片、飽和醋酸鈾、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察，拍片。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2-VO大鼠不同時期腦血流改變

ASL結(jié)果顯示，與對照組相比，2-VO術(shù)后 3 d時頂葉皮質(zhì)血流量為對照組的35%，2-VO術(shù)后 14 d時血流量為對照組的57%，2-VO 術(shù)后 30d時血流量為對照組的80%(圖1)，2-VO模型大鼠大腦皮質(zhì)處于持續(xù)血流低灌注狀態(tài)。

2.2 BBB改變

纖維蛋白原免疫熒光染色結(jié)果顯示，2-VO術(shù)后3、14和30 d時血管周圍均有纖維蛋白原滲漏，并且隨著時間延長纖維蛋白原血管外沉積逐漸增多(圖2A)；電鏡下觀察，與對照組相比，腦慢性缺血后可出現(xiàn)血管基膜增厚、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突腫脹、血管外周圍間隙致密物質(zhì)沉積以及紅細(xì)胞滲漏等(圖2B)。2-VO模型不同時期均出現(xiàn)BBB損傷。

2.3 慢性腦血流低灌注對周細(xì)胞的影響

血管周細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，2-VO術(shù)后 3 d周細(xì)胞數(shù)量開始增多，為對照組的1.5倍，14 d時周細(xì)胞數(shù)量增加到對照組的2倍，至術(shù)后30 d時有所下降，為對照組的1.4倍(圖3A、C)；血管內(nèi)皮免疫熒光染色結(jié)果顯示，模型組各個時期深部腦皮質(zhì)血管數(shù)量與對照組相比無明顯變化(圖3B、D)；采用不同濃度纖維蛋白原處理原代培養(yǎng)周細(xì)胞，CCK-8檢測細(xì)胞的增生情況，與對照組相比，0.25 g/L纖維蛋白原對周細(xì)胞無增生或毒性作用，而0.5、1、1.5、2.5、5和10 g/L纖維蛋白原對周細(xì)胞均有促增生作用，在1 g/L 細(xì)胞活力最高，達(dá)到120%；20 g/L時周細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡，細(xì)胞活力為對照組的75%(圖3E)。

圖1 腦血流改變Fig.1 Changes of CBF by ASL

*P<0.05vscontrol,***P<0.001vscontrol,n= 6；CBF: cerebral blood flow;ASL: arterial spin labeling；2-VO:two-vessel occlusion.

圖2 大鼠大腦皮質(zhì)血-腦脊液屏障改變Fig.2 BBB changes in different stages of 2-VO rat model

A: fibrinogen leakage in the cortex, COL4α for type IV collagen (red), fibrinogen (green); bar=75μm;B: electron microscopic image of BBB in the cortex;a: astrocytic foot;b: red blood cell leakage;c: vascular lumen;p: pericyte;Thinarrow: vascular basement membrane;Thickarrow: the dense deposit in the extravascular space; Bar=1μm (n=3);BBB：blood brain barrier；2-VO:two-vessel occlusion.

3 討論

大鼠2-VO模型被廣泛用于CCH損傷的研究，該模型中血管閉塞穩(wěn)定且持久，腦灌注不足是全腦性的，不出現(xiàn)局灶性腦梗死。急性期CBF急劇下降至正常水平的35%～45%，由于Willis環(huán)的代償作用，1周后開始逐漸恢復(fù)進(jìn)入慢性期，至3個月時CBF仍維持在正常的80%左右，此期與老齡化及AD患者的腦血流變化最相似[3]。本實驗結(jié)果為2-VO術(shù)后 3 d時頂葉皮質(zhì)CBF為對照組的35%，2-VO術(shù)后14 d時CBF為對照組的57%，2-VO 術(shù)后 30 d時血流量為對照組的80%，此結(jié)果與文獻(xiàn)[3]報道相一致。

圖3 大鼠大腦皮質(zhì)周細(xì)胞數(shù)量變化以及纖維蛋白原對周細(xì)胞增生的影響Fig.3 Number of pericytes in cortex and the effect of fibrinogen on pericytes proliferation

A: PDGFRβ+pericyte, bar=50 μm;B: CD31+endothelial cells, bar=100 μm;C: number of pericyte;D: vascular number;E: pericyte activity assay；*P<0.05,**P<0.01vscontrol,##P<0.05vs2-VO 14 d (n= 3);2-VO:two-vessel occlusion.

BBB主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞足突組成[7]。其中內(nèi)皮細(xì)胞及其之間的緊密連接形成物理屏障；星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白維持基底膜的功能，并完成血管和神經(jīng)元之間的信號傳遞。正常情況下，血液中的大分子物質(zhì)如纖維蛋白原、纖維蛋白等不能通過BBB進(jìn)入腦實質(zhì)，而在缺血條件下，氧化應(yīng)激增加[8]、炎性細(xì)胞浸潤[9]等參與破壞微血管完整性，導(dǎo)致通透性增高，血漿蛋白滲漏。本實驗中觀察到2-VO模型組有纖維蛋白原的血管外滲漏，并且在電鏡下觀察到BBB超微結(jié)構(gòu)的改變，說明在CCH損傷過程中大腦皮質(zhì)存在BBB的損傷。

周細(xì)胞為BBB的重要組成部分，其主要功能除了維持BBB穩(wěn)定之外，還包括調(diào)節(jié)CBF及血氧代謝、調(diào)節(jié)血管穩(wěn)定性、神經(jīng)干細(xì)胞功能和吞噬細(xì)胞活性等[10-12]。本研究中觀察到，2-VO 術(shù)后3 d周細(xì)胞數(shù)量開始增多，至14 d時周細(xì)胞數(shù)量最多，后期隨著缺氧時間的延長，周細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。然而血管數(shù)量并沒有明顯變化，因此周細(xì)胞增生并非由血管增多所引起。在慢性缺血早期，腦血流的減少還可能與周細(xì)胞的收縮有關(guān)[13]，因此在CCH早期周細(xì)胞的增多可能進(jìn)一步加劇CBF減少，加速BBB損傷。有研究[14]顯示，纖維蛋白原的滲出可刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的變化，那么滲出的纖維蛋白是否對周細(xì)胞的增生有影響？因此本研究通過體外培養(yǎng)周細(xì)胞，檢測不同濃度纖維蛋白原對周細(xì)胞的增生或毒性作用。結(jié)果表明低濃度纖維蛋白原對周細(xì)胞具有一定的促增生作用，而高濃度纖維蛋白原對周細(xì)胞具有毒性作用。因此CCH模型中早期觀察到的周細(xì)胞數(shù)量增多可能與早期少量纖維蛋白原的滲漏有關(guān)，慢性期時周細(xì)胞數(shù)量的減少，可能與腦組織中纖維蛋白原累積增多，對周細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用有關(guān)。有研究[15]表明，周細(xì)胞可以分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和9(MMP-2、MMP-9)，而MMP-2、MMP-9被蛋白水解酶激活后可作用于基底膜，破壞BBB[16-18]，因此周細(xì)胞的增生可能進(jìn)一步加劇了BBB的損傷。當(dāng)然這一假設(shè)需要后續(xù)實驗的進(jìn)一步驗證。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，CCH可破壞BBB，早期伴有周細(xì)胞增生。BBB損傷導(dǎo)致的纖維蛋白原滲出可能是引起周細(xì)胞增生的主要原因，同時周細(xì)胞增生也可能進(jìn)一步加重腦缺血及BBB損傷。