馬池發(fā) 史婷婷，2 劉敬怡，2 宋麗妮，2 馮建萍，2 袁明霞，2* 楊金奎，2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730；2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)經(jīng)典作用是調(diào)節(jié)血壓及維持水電解質(zhì)平衡，近年來研究[1-4]證實RAS系統(tǒng)參與調(diào)解糖代謝及脂代謝。RAS系統(tǒng)新發(fā)現(xiàn)的成員血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)，可將血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)分解為血管緊張素(1-7)[angiotensin (1-7)， Ang(1-7)]，后者通過Mas受體發(fā)揮作用，形成ACE2/Ang(1-7)/Mas軸與經(jīng)典的ACE/AngⅡ/AT1軸相拮抗。脂肪組織是胰島素作用的重要的靶器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，能分泌多種細胞因子、激素影響糖脂代謝。RAS系統(tǒng)的成員在脂肪組織表達[5]，并參與調(diào)解脂肪組織脂代謝，AngⅡ促進脂肪合成[6]，促進脂肪細胞釋放炎性反應因子[7]。但是ACE2/Ang(1-7)對脂肪組織脂代謝的作用目前研究較少。本研究選用兩種不同的動物模型，研究ACE2/Ang(1-7)對脂肪組織脂肪合成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取雄性8周齡ACE2基因敲除(angiotensin-converting enzyme 2-knockout，ACE2KO)小鼠8只，以體質(zhì)量相當?shù)男坌?周齡C57BL/6 (wild-type，WT)小鼠8只作為對照，給予高脂飲食[20%(質(zhì)量分數(shù))蛋白、35%(質(zhì)量分數(shù))碳水化合物、45%(質(zhì)量分數(shù))脂肪]飼養(yǎng)。

選取體質(zhì)量接近的雄性8周齡2型糖尿病db/db小鼠，采用數(shù)字表法隨機分為3組，每組8只，予普通飲食。于無菌條件下皮下植入ALzet 微量泵(型號1002)，分別給予A779[D-Ala7-Ang(1-7)](500 μg·kg-1·d-1)、Ang(1-7)(500 μg·kg-1·d-1)+A779 (500 μg·kg-1·d-1)以及相同劑量的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液干預4周。Ang(1-7)(貨號H1715)及A779(貨號H2888)購于瑞士Bachem公司。

所有動物購于南京大學模式動物研究所，實驗所使用動物均經(jīng)過首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院動物委員會批準。動物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級別，自由攝水，每天光照12 h。 溫度18～23 ℃，濕度50%～60%，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2005-0001。

1.2 檢測體質(zhì)量、取材、計算體脂率

飼養(yǎng)4周后測小鼠體質(zhì)量。將小鼠斷頸處死，PBS灌流組織，留取附睪脂肪及皮下脂肪稱質(zhì)量，計算小鼠體脂率(脂肪質(zhì)量與體質(zhì)量之比)。

附睪脂肪同一部位放入4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛固定以做HE染色，剩余部分放入液氮轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱凍存留作Western blotting法檢測。

1.3 血脂測定

小鼠處死前毛細管內(nèi)眥取血800 μL，4 ℃ 4 000 r/min 離心10 min，留取血清測血脂。血漿三酰甘油(triglyceride，TG)測定采用GPO-PAP法?？偰懝檀?total cholesterol，TC)測定采用CHOD-PAP法。 試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司。分別對標準品、對照品和待測樣品進行測量，采用Bio-Rad酶標儀讀取測定。

1.4 附睪脂肪組織HE染色

附睪脂肪組織4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、制成5 μm石蠟切片，HE 染色后顯微鏡下觀察。

1.5 Western blotting法檢測

用RIPA強裂解液(加入PMSF100X，Cocktail25X)裂解小鼠附睪脂肪，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF上，用含5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉的TBST溶液封閉1.5 h，加入稀釋的一抗于 4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5～10 min，加入 1∶2 000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，滴加增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)化學發(fā)光液，用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)顯影成像，并用Image Lab 軟件灰度分析。乙酰輔酶A 羧化酶ɑ(acetyl-CoA carboxylase ɑ，ACCɑ)抗體購于美國Santa Cruz公司(貨號Sc-30212)，β-actin(貨號8457)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)抗體(貨號3180) 抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，aP2)(貨號ab23693)抗體購于英國Abcam公司。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ACE2敲除后對小鼠體質(zhì)量及體脂率的影響

高脂飲食喂養(yǎng)小鼠4周后，ACE2 基因敲除小鼠與野生對照小鼠相比，體質(zhì)量無明顯變化；肉眼觀察脂肪組織大體標本，ACE2基因敲除鼠脂肪量明顯多于野生對照鼠；體脂率測定明顯高于野生對照鼠(P<0.05)(圖1)。

2.2 ACE2敲除后對小鼠血脂的影響

高脂飲食喂養(yǎng)小鼠4周，ACE2基因敲除小鼠血清TG濃度較對照組明顯升高(P<0.05)，TC濃度在兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(圖2)。

2.3 ACE2敲除后對小鼠附睪脂肪細胞形態(tài)學的影響

HE染色結(jié)果顯示，野生對照小鼠附睪脂肪細胞排列較緊密，細胞邊緣較清晰；ACE2基因敲除鼠附睪脂肪細胞體積與對照小鼠相比增大，且細胞邊緣更模糊(圖 3)。

A：weight;B:adipose tissue of WT mice;C:adipose tissue ofACE2KO mice;D:body fat percentage;*P<0.05，n=6;WT：wild type；ACE2:angiotensin-converting enzyme 2;ACE2KO:angiotensin-converting enzyme 2-knockout.

圖2 ACE2基因?qū)π∈笱挠绊慒ig.2 Effect of ACE2 gene on serum cholesterol andtriglyceride in mice

A:TG;B:TC;*P<0.05，n=6.ACE2:angiotensin-converting enzyme2;ACE2KO:angiotensin-converting enzyme2-knockout；TG：triglycerides；TC：total cholesterol；WT：wild type.

圖3 ACE2基因敲除鼠和野生鼠附睪脂肪細胞HE染色Fig.3 Hematoxylin and eosin staining of epididymaladipocytes in ACE2KO and WT mice(HE,400×)

A：epididymal adipocytes of WT mice；B：epididymal adipocytes ofACE2KO mice；WT：wild-type；ACE2：angiotensin-converting enzyme 2 ；ACE2KO：angiotensin-converting enzyme2-knockout.

2.4 ACE2基因敲除后對附睪脂肪合成因子的影響

Western blotting法檢測結(jié)果示，ACE2基因敲除鼠附睪脂肪ACCα、FAS的蛋白表達高于野生對照小鼠，差異有統(tǒng)計學意義，ACE2基因敲除鼠的aP2蛋白表達有高于野生對照小鼠的趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05, 圖4)。

圖4 ACE2基因?qū)π∈蟾讲G脂肪組織脂肪合成因子蛋白表達的影響Fig.4 Effect of ACE2 on the lipogenesis related genesexpression in epididymal adipose tissue of mice

A：representative Western blotting for ACCɑ，F(xiàn)AS and aP2；B：statistical analysis for protein level；ACE2：angiotensin-converting enzyme 2；ACE2KO：angiotensin-converting enzyme2-knockout ；WT：wild-type；ACCɑ：acetyl-CoA carboxylase ɑ；FAS：fatty acid synthetase；aP2：adipocyte fatty acid binding protein；*P<0.05.

2.5 Ang(1-7)對db/db小鼠體質(zhì)量的影響

Ang(1-7)皮下泵干預小鼠4周后，小鼠體質(zhì)量與0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液處理組相比沒有明顯變化。應用Ang(1-7)的拮抗劑A779拮抗Ang(1-7)后對體質(zhì)量無明顯影響(圖5)。

圖5 Ang(1-7)及Ang(1-7)+A779干預對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of Ang(1-7) and Ang(1-7)+A779 onbody weight in db/db miceAng(1-7)：angiotensin (1-7); A779: D-Ala7-Ang(1-7).

2.6 Ang(1-7)對db/db小鼠附睪脂肪合成因子的影響

Ang(1-7)干預db/db小鼠4周后， 其附睪脂肪ACCα及FAS蛋白的表達較0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液處理組下調(diào)，加用Ang(1-7)的拮抗劑A779干預后ACCα及FAS蛋白的表達較Ang(1-7)干預組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(圖6)。

圖6 Ang(1-7)、Ang(1-7)+A779干預對db/db小鼠附睪脂肪組織脂肪合成因子蛋白表達的影響Fig.6 Effect of Ang(1-7),Ang(1-7)+A779 onlipogenesis related genes expression in epididymaladipose tissue of db/db mice

A:representative Western blotting for ACCɑ and FAS;B:statistical analysis for protein level;Ang(1-7): angiotensin(1-7);A779: D-Ala7-Ang(1-7);ACCɑ：acetyl-CoA carboxylase ɑ；FAS：fatty acid synthetase；*P<0.05，**P<0.01.

3 討論

哺乳動物白色脂肪組織主要功能是以TG的形式存貯能量，同時它也是重要的內(nèi)分泌器官，分泌激素、細胞因子等通過自分泌、內(nèi)分泌、旁分泌方式發(fā)揮作用[8]。白色脂肪在高血糖、高血壓、脂代謝紊亂、肥胖等代謝綜合征及胰島素抵抗發(fā)生中起重要作用。肥胖患者中RAS系統(tǒng)是過度激活的[9]，與胰島素抵抗密切相關(guān)。研究[10]表明，RAS系統(tǒng)中ACE2/Ang(1-7)/Mas軸拮抗ACE/AngⅡ/AT1軸的作用。ACE/AngⅡ/AT1軸的經(jīng)典作用有收縮血管，引起醛固酮的釋放、保鈉、保水，近年來更多的研究[1， 11]是關(guān)注其對糖脂代謝的影響。Ang(1-7)可對抗AngⅡ的血管收縮、促纖維化、促生長效應[12]，可改善脂肪細胞氧化應激，增加葡萄糖攝取[13]。

目前關(guān)于RAS對脂肪代謝的影響有一些相關(guān)報道。AngⅡ可通過AT1受體抑制脂肪細胞分化[14]和脂肪分解[11]，缺乏AT1a受體可減輕飲食誘導的肥胖[15]，但是目前ACE2/Ang(1-7)/Mas軸對脂肪代謝并沒有深入探討。有研究[16]表明，Ang(1-7)能上調(diào)FAS、ACC、aP2等因子表達促進脂肪細胞形成，也有研究[17-18]證實ACE2受體激動劑三氮脒(diminazene aceturate，DIZE)下調(diào)ACCα及FAS等因子抑制脂肪合成。為了更加明確ACE2/Ang(1-7)對脂肪合成的影響，本研究中選用ACE2敲除及2型糖尿病db/db小鼠兩種動物模型，以其附睪脂肪作為白色脂肪的代表，正反兩方面論證ACE2/Ang(1-7)對白色脂肪組織脂肪合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE2基因敲除后，小鼠的體脂率及血脂濃度明顯升高，同時，Western blotting法檢測結(jié)果顯示ACE2敲除后脂肪合成關(guān)鍵因子ACCα及FAS的蛋白表達升高。這些結(jié)果表明，ACE2敲除后小鼠的脂肪合成是上調(diào)的。本研究同時應用Ang(1-7)干預2型糖尿病db/db小鼠，發(fā)現(xiàn)Ang(1-7)抑制了附睪脂肪組織脂肪合成因子的表達，同時這一作用被Ang(1-7)的拮抗劑A779所拮抗。這一發(fā)現(xiàn)與ACE2基因敲除小鼠的結(jié)果相吻合。

本研究證明了ACE2/Ang(1-7)對白色脂肪合成的抑制作用，但是仍有不足之處：(1)Ang(1-7)的受體主要為Mas受體，本研究未針對Mas受體對脂肪代謝的影響進行研究。下一步本課題組將構(gòu)建Mas基因敲除小鼠進一步研究Mas基因?qū)π∈笾窘M織脂代謝的影響。(2)本實驗選用ACE2基因敲除小鼠，不排除器官之間相互影響，課題組擬構(gòu)建ACE2脂肪特異性敲除小鼠進一步研究脂肪組織局部RAS對脂代謝的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明， ACE2/Ang(1-7) 抑制小鼠白色脂肪組織的脂肪合成，其機制可能是通過抑制脂肪合成關(guān)鍵因子的表達發(fā)揮作用。這一結(jié)果對研究RAS系統(tǒng)參與胰島素抵抗發(fā)生的機制及發(fā)現(xiàn)改善胰島素抵抗的新靶點可能提供新的思路。