曹 曦 宋麗妮 張怡塵 李 奇 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730；2.糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730)

基因修飾動(dòng)物模型是在活體動(dòng)物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標(biāo)的重要工具[1]。近年來新興的一種來源于細(xì)菌的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat， CRISPR)及臨近相關(guān)基因(CRISPR-associated， Cas)系統(tǒng)經(jīng)過改造后，因其操作簡便、效率高而成為最熱門的基因編輯技術(shù)，即 CRISPR/Cas9 技術(shù)。其與鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease， ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease， TALEN)一樣可用于各種復(fù)雜基因組的編輯。目前CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功在細(xì)菌、水稻、小鼠、大鼠、斑馬魚、人等物種上得到運(yùn)用[2-3]，由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具。

CRISPR/Cas9技術(shù)的具體原理是：Cas9 是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，能與 sgRNA(single-guide RNA)結(jié)合，sgRNA 是人工合成的 tracrRNA(trans-activating RNA)/crRNA(crispr RNA)復(fù)合體。sgRNA 3′端 20個(gè)堿基通過堿基配對原則與目標(biāo) DNA 配對結(jié)合，其中sgRNA 所識(shí)別配對序列緊緊相鄰的目標(biāo)DNA 序列必須是NGG(N代表任一堿基，即前導(dǎo)間隔相鄰基序列 (protospacer adjacentmotif， PAM)[4]，然后Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶標(biāo)的特定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，打斷目標(biāo)基因，再通過非同源重組(non-homologous end-joining， NHEJ)修復(fù)機(jī)制，隨機(jī)插入或刪除一定數(shù)量的堿基，產(chǎn)生錯(cuò)誤修復(fù)甚至移碼突變，而達(dá)到敲除靶基因的目的[5]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system， RAS)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、糖尿病心肌病及糖尿病腎病中起重要作用。ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸作為新發(fā)現(xiàn)的 RAS 調(diào)節(jié)軸，可拮抗經(jīng)典軸ACE/Ang Ⅱ/AT1(Ang Ⅱtype 1 receptor)的生物效應(yīng)。在2001～2002年間，兩個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)了屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的新型受體，該受體被命名為Mrg[6]或與感覺神經(jīng)元有關(guān)的特異性G蛋白偶聯(lián)受體(sensory neurons specic receptor, SNSR)[7]。其中，MrgD是Mrg家族的一員，最初被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)性疼痛的調(diào)節(jié)中起作用[8]。眾所周知，Ang(1-7)已被確定為Mas受體的天然內(nèi)源性配體[9]。然而，進(jìn)一步研究[10]顯示，Mrg家族與Mas受體有很高的同源性，并且用Ang(1-7)作用于過表達(dá)MrgD的細(xì)胞后促進(jìn)了花生四烯酸的釋放與轉(zhuǎn)錄激活。這些研究說明在Mrg受體家族和RAS之間可能存在著相互作用。所以，本研究運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)，設(shè)計(jì)了針對MrgD的sgRNA，成功誘導(dǎo)了MrgD的靶向突變，初步篩選后獲得MrgD基因敲除的小鼠，為糖尿病發(fā)病機(jī)制研究提供了動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的小鼠均為 C57BL/6J 品系，體質(zhì)量18～24 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(京) 2016-0011]。小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫恒濕，12 h光照，12 h黑暗，自由采食。實(shí)驗(yàn)所使用的所有動(dòng)物均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的選擇

筆者從NCBI小鼠基因組網(wǎng)站得到MrgD基因(Gene ID: 211578)的序列和結(jié)構(gòu)信息。遵從CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)突變靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用在線sgRNA靶序列設(shè)計(jì)軟件(http://crispr. mit. edu/)，將小鼠MrgD基因(NM-203490.3)第一個(gè)外顯子序列進(jìn)行分析，得到評分較高的sgRNA序列(靶點(diǎn)序列：5′-CTCGCCATGGCCACGTGTGT-3′)。

1.2.2 顯微操作與F0代鑒定

上述sgRNA及Cas9 mRNA進(jìn)行小鼠受精卵胞質(zhì)注射、回輸、分娩等常規(guī)操作。3周齡F0代小鼠剪取尾尖0.5 cm置于1.5 mL的EP管內(nèi)，加入500 μL裂解液和1 μL蛋白酶K貯存液，將上述EP管置于55 ℃恒溫水浴鍋水浴過夜，待消化完全，酚/氯仿法抽提基因組 DNA。以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增sgRNA靶向位點(diǎn)兩側(cè)各約200bp的序列。引物序列如下：MF， 5′-TGGCAGAGAGGTGGAGTGTA-3′; MR， 5′-ATGGGGAAAAGCACGGAGAG-3′。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、變性、緩慢退火，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。為進(jìn)一步驗(yàn)證，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測序(測序由諾賽基因公司完成)。

1.2.3 繁育MrgD基因敲除的純合小鼠

將含有MrgD基因大片段敲除的F0代小鼠與野生型C57BL/6J小鼠進(jìn)行繁育，得到F1代小鼠。剪取尾尖0.5 cm，經(jīng)消化提取基因組DNA，用引物MF及MR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定及測序，篩選F1代(雜合子)。然后，以篩選出的F1代(雜合子)小鼠作為親本，交配繁育F2代，得到的F2代再進(jìn)行基因鑒定，最終得到MrgD基因敲除純合體小鼠，從而建立突變?nèi)后w。

1.2.4 體質(zhì)量監(jiān)測

將小鼠分為4組(每組10只)：同周齡雄性C57BL/6J小鼠(A組)、同周齡雌性C57BL/6J小鼠(B組)、同周齡雄性MrgD敲除(MrgD-/-)小鼠(C組)及同周齡雌性MrgD-/-小鼠(D組)，以普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)并監(jiān)測體質(zhì)量。

1.2.5 空腹血糖監(jiān)測

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)至16周齡時(shí)尾靜脈取血測小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)(0 min)，血糖測定用強(qiáng)生公司One-Touch血糖儀及配套試紙。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建MrgD大片段基因敲除小鼠

MrgD基因sgRNA及驗(yàn)證引物序列如圖1所示。將sgRNA及Cas9 mRNA混合物通過顯微注射注入小鼠受精卵胞質(zhì)，然后回輸移植到假孕的C57BL/6J母鼠中，共得到7只F0代小鼠，分別編碼為1#～7#。對這7只小鼠進(jìn)行基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增，并且通過瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定(圖2)。結(jié)果表明，與野生型C57BL/6J小鼠基因型相比，6#小鼠發(fā)生了堿基的插入或缺失，而1、2、3、4、5及7#可能仍為野生型基因型。

為進(jìn)一步確定基因型，將1#～7#小鼠基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做TA克隆測序。同時(shí)，對6#小鼠基因組DNA與野生型C57BL/6J小鼠基因進(jìn)行比對，6#小鼠缺失173個(gè)堿基，其中123個(gè)堿基位于CDS區(qū)域，即敲除了MrgD蛋白的前41個(gè)氨基酸(圖3)，長片段(500bp)比對結(jié)果表明不完全匹配，表明6#小鼠可能為嵌合體。因此，6#小鼠為成功構(gòu)建的MrgD大片段基因敲除(嵌合體)的F0代小鼠。

圖1 MrgD基因sgRNA及驗(yàn)證引物序列Fig.1 SgRNA and validation primer sequence for MrgD

圖2 PCR擴(kuò)增MrgD基因敲除序列附近PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of MrgD， delete PCR product near the sequence

圖3 F0代MrgD-/--6#小鼠與野生型小鼠MrgD靶序列比對Fig.3 Target sequences of MrgD in 6# F0 mouse mated with wild type mice

2.2 MrgD基因敲除小鼠與C57BL/6J野生型小鼠的體質(zhì)量比較

MrgD基因敲除6#小鼠F0通過與C57BL/6J野生型雌性小鼠繁育得到陽性F1代，陽性F1代小鼠繁育得到F2代MrgD-/-純合小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并且以普通飼料喂養(yǎng)。通過對4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量的長期監(jiān)測，雄性和雌性C57BL/6J野生型小鼠以及MrgD-/-小鼠體質(zhì)量隨喂養(yǎng)時(shí)間均穩(wěn)定增長。其中，雄性C57BL/6J野生型小鼠以及MrgD-/-小鼠體質(zhì)量于16、17及18周兩組體質(zhì)量達(dá)到一致，18周以后雄性MrgD-/-小鼠體質(zhì)量增長明顯高于雄性C57BL/6J野生型小鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A)。此外，雌性MrgD-/-小鼠體質(zhì)量均稍低于雌性C57BL/6J野生型小鼠，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。

圖4 各組小鼠間體質(zhì)量的比較Fig.4 Comparison of weight among different mice groups

A：comparison of weight between group A and C；B：comparison of weight between group B and D；groupA: C57BL/6J male mice;groupB: C57BL/6J female mice;groupC:MrgD-/-male mice;groupD:MrgD-/-female mice.

2.3 各組小鼠空腹血糖比較

分別對普通飼養(yǎng)的18周齡雄性C57BL/6J小鼠(A組)與MrgD-/-小鼠(C組)，以及同周齡雌性C57BL/6J小鼠(B組)與MrgD-/-小鼠(D組)進(jìn)行空腹血糖測定。結(jié)果顯示，雄性MrgD-/-小鼠與C57BL/6J小鼠空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A)，同樣的，雌性MrgD-/-小鼠與C57BL/6J小鼠空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)筆者計(jì)劃通過高糖、高脂等特殊條件誘導(dǎo)，對MrgD-/-小鼠糖脂代謝進(jìn)行深入研究。

3 討論

胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制。其中，胰島素抵抗表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的攝取減少以及抑制肝糖輸出的作用減弱[11]。目前，ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸作為新發(fā)現(xiàn)的 RAS 調(diào)節(jié)軸在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題組研究結(jié)果表明ACE2/Ang-(1-7)的上調(diào)可以改善小鼠胰島細(xì)胞的氧化應(yīng)激從而減少凋亡，增加胰島素的分泌[12]，同時(shí)，也可以通過PI3K/Akt通路降低肝細(xì)胞糖異生相關(guān)酶的表達(dá)[13]，從而改善血糖水平。另一方面，研究[14]表明ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸的激活可以降低骨骼肌、脂肪細(xì)胞中的活性氧簇(reactive oxygen species， ROS)，增加胰島素刺激的葡萄糖攝取，從而改善糖代謝。然而，最近發(fā)現(xiàn)的MrgD作為Mrg家族的一員，其轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白與Mas受體一樣作為Ang(1-7)多肽作用的另一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的受體，并且存在著與Ang(1-7)類似的可作用于MrgD受體的多肽[15]。研究表明MrgD可能參與了肺癌等腫瘤的發(fā)生[16]、增加神經(jīng)元興奮性反應(yīng)與調(diào)節(jié)疼痛感覺[17]等過程。但是，MrgD作為Ang(1-7)的受體所起的生理作用還不清楚。所以，構(gòu)建MrgD敲除小鼠模型進(jìn)行后續(xù)一系列研究就顯得極為重要。

圖5 各組小鼠空腹血糖的比較Fig.5 Comparison of fasting blood glucoseamong different mice group

A：comparison of FBG between group A and C；B：comparison of FBG between group B and D；groupA: C57BL/6J male mice;groupB: C57BL/6J female mice;groupC:MrgD-/-male mice;groupD:MrgD-/-female mice.n=10.FBG: fasting blood glucose;MrgD-/-:MrgDknockout mice.

CRISPR/Cas9技術(shù)因其操作簡便、效率高而成為最熱門的基因編輯技術(shù)，本研究通過應(yīng)用在線sgRNA靶序列設(shè)計(jì)軟件對小鼠MrgD基因(NM-203490.3)序列進(jìn)行分析，得到評分較高的sgRNA，并通過擴(kuò)增后與Cas9 mRNA混合一起通過顯微注射注入小鼠受精卵胞質(zhì)，再進(jìn)行回輸、代孕等操作，最終獲得F0代。本實(shí)驗(yàn)成功獲得F0代的6#小鼠(嵌合體)，通過繁育最終獲得MrgD基因敲除純合突變體小鼠。雖然，在普通條件飼養(yǎng)下本研究未顯示MrgD基因敲除小鼠與野生型對照鼠的體質(zhì)量和血糖差異，但是后期實(shí)驗(yàn)通過高糖、高脂等特色條件誘導(dǎo)MrgD基因敲除小鼠，相信能對MrgD基因進(jìn)行更深入有效的研究。

本研究成功構(gòu)建了MrgD基因敲除小鼠模型，并進(jìn)行了初步試驗(yàn)，但還存在一些問題，比如只是在普通飼料喂養(yǎng)下進(jìn)行了體質(zhì)量與血糖的檢測，后續(xù)應(yīng)該再進(jìn)行以高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)后監(jiān)測血糖，并更進(jìn)一步進(jìn)行糖脂代謝相關(guān)研究。從而為MrgD基因功能與糖尿病相關(guān)性的研究提供新的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和結(jié)果。