趙 桐 胡曉晴 朱德財 田 晶 辛琪琪 劉雪梅

(東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

APETALA2/ethylene-responsive element binding protein(AP2/EREBP)轉錄因子家族普遍存在于所有植物中，參與植株的生長發(fā)育、脅迫應答和多種生理生化反應的信號轉導。近年來，在動物中也已經發(fā)現其家族成員[1]。該家族中的AP2轉錄因子亞家族參與調控花、胚珠和種子的發(fā)育。APETALA2(AP2)基因是AP2亞家族的成員，作為花發(fā)育模型中的A類基因，參與植物花器官的發(fā)育過程，控制萼片和花瓣的生長[2]。AP2基因與其他花發(fā)育基因不同，具有獨特的AP2結構域[3]，該結構域能識別DNA并結合。近年來的研究發(fā)現，矮牽?；?Petuniahybrida)的AP2類基因對花的發(fā)育產生影響[4]，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達挪威云杉(Piceaabies)的PaAP2L2基因會阻礙植株生長[5]，在雜交落葉松(Larix×marschlinsii)中發(fā)現的AP2同源類似物LmAP2L1和LmAP2L2，直接影響其體細胞的胚胎發(fā)生和萌發(fā)[6]，蘋果(Maluspumila)的MAP2A基因，被發(fā)現在其多種組織中表達[7]，而玉米(ZeamaysL.)的AP2-like基因在18種組織中均表達[8]，水稻(Oryzasativa)的OsAP2-1基因在花和根中有較高表達[9]，不同植物中AP2基因的功能不盡相同，為研究AP2基因對白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)生長發(fā)育過程的影響，本試驗通過克隆其特異性啟動子展開對其表達模式的研究。

白樺是我國東北地區(qū)重要的闊葉樹種，是國家科技支撐計劃研究的重點樹種之一，具有極高的研究和利用價值。因其具有纖維素含量高而木質素含量低的優(yōu)良纖維性狀，白樺成為優(yōu)良的造紙原材料，其光滑細致的削面和富有韌性抗沖擊的特點，又使其成為極受歡迎的板材。白樺生長周期和有性生殖周期較長，雌雄花均為不完全花，且花器官退化為兩輪，花發(fā)育的關鍵階段歷時短，胚胎學上已對白樺生殖發(fā)育的研究有部分報道[10～13]，但對其內在的分子機制還是研究甚少。本實驗室先期已進行了部分白樺花發(fā)育過程涉及的其他相關基因的克隆與研究，本試驗在此基礎上，構建BpAP2特異啟動子驅動的GUS表達載體，通過農桿菌介導轉化法，研究其組織表達模式，為后續(xù)更深入探究BpAP2基因在白樺生長發(fā)育過程中的功能、分析白樺生殖發(fā)育機制、改良白樺遺傳育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

轉化材料為白樺四周齡組培苗第二和第三片葉、成年白樺的雌雄花及哥倫比亞擬南芥實生苗。DNA提取材料為白樺四周齡組培苗葉片，取材后液氮處理，隨即置于-80℃冰箱保存。

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒以及普通質粒小提試劑盒購自北京天根公司。KOD FX Neo酶購自TOYOBO公司、核酸分子量標準(DNAmarker ladder)、T4-DNA連接酶、限制性內切酶ClaⅠ和XbaⅠ等購自NEB公司。GUS(β-葡萄糖苷酶,β-glucuronidase)組織化學染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)購自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 白樺BpAP2基因啟動子的克隆和元件分析

根據已知的BpAP2基因序列(圖4)，與白樺基因組數據庫進行比對，得到啟動子序列，命名為proBpAP2，設計含酶切位點的全長引物F(CCATCGATTAGACGGAATAGACGCACTT，下劃線處為酶切位點ClaⅠ)和R(CGTCTAGAACGAGAACCCGAACAACT，下劃線處為酶切位點XbaⅠ)。以白樺組培苗葉片基因組為模板擴增全長啟動子序列，PCR反應程序參照TOYOBO KOD FX Neo說明書：94℃，2 min；98℃，10 s；65℃，30 s，每循環(huán)降低0.5℃；68℃，35 s，共15次循環(huán)；98℃，10 s；50℃，30 s；68℃，35 s；共15次循環(huán)；68℃，7 min?？寺≈帘磉_載體pBI121-35S::GUS后測序鑒定，命名為pBI121-proBpAP2::GUS質粒，利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析軟件進行啟動子元件分析。

1.3.2 農桿菌滲透法轉化白樺及擬南芥

將構建好的pBI121-proBpAP2::GUS質粒用液氮法轉入農桿菌EHA105菌株。參照李萌等[14]的方法侵染白樺，程序如下：培養(yǎng)菌液至OD600=0.5，用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600=0.8，將白樺組培苗葉片放入，25℃ 120 r·min-1培養(yǎng)2 d，每16 h更換1次新鮮1/2MS液體培養(yǎng)基。

擬南芥的轉化參照郭勇等[15]的方法，當菌液OD600為0.6～0.7時，5 000 r·min-1離心7 min收集菌體。將擬南芥置于25%蔗糖質量分數的1/4MS高滲溶液中25℃下浸泡15 min，轉入OD600=1.0的侵染液中，25℃搖床內120 r·min-1培養(yǎng)2.5 h，500 mmol·L-1甘露醇洗3 min，取出后置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，放在(23±2)℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h。

1.3.3 GUS染色

X-GLUC染色液配制和染色參照郭勇等[15]的方法，染液配方：200 mmol·L-1的磷酸緩沖液50 mL(pH=7.0)；100 mmol·L-1的Na2EDTA溶液10 mL，5 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]10 mL，5 mmol·L-1的K4[Fe(CN)6]10 mL，100% Triton-100 10 μL，X-GLUC 60 mg。將侵染后的擬南芥和白樺苗放入含有染液的50 mL離心管中，37℃黑暗染色過夜，卡諾固定液脫色1～3 h，觀察拍照，每個實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 白樺AP2啟動子的獲得及表達載體構建

以白樺組培苗DNA為模板PCR擴增獲得長度為2 308 bp的單一條帶(圖1)，測序后確認為白樺AP2基因的啟動子序列proBpAP2，將其與植物表達載體pBI121-35S::GUS重組后獲得proBpAP2特異啟動子驅動的植物表達載體，命名為pBI121-proBpAP2::GUS(圖2)。

圖1 proBpAP2啟動子片段的擴增Fig.1 Amplification of proBpAP2 fragment M.DL5000 marker

圖2 proBpAP2-pBI121-GUS表達載體構建示意圖Fig.2 pBI121-BpAP2::GUS expression vector construction diagram

2.2 白樺proBpAP2啟動子序列分析及順式元件預測

利用PLACE和Plantcare在線軟件分析，發(fā)現proBpAP2啟動子序列除含有大多數高等植物啟動子共有的TATA Box和CAAT Box保守元件外，還包含大量光調控元件如3-AF1 binding site、Box4、BoxⅠ、CATT-motif、GA-motif、GAG-motif、GT1-motif、SP1、TCCC-motif、BoxⅡ、as-2-box、chs-CMA2b，另外還有涉及ABA響應的CE3和ABRE，MeJA響應的TGACG-motif和CGTCA-motif，GA3響應的GARE-motif，低溫響應的LTR元件，SA響應的TCA-element，生長素響應的TGA-element(表1)及高轉錄水平作用元件。除上述響應元件外，proBpAP2還具有節(jié)律調節(jié)元件，分生組織和胚乳表達元件以及厭氧誘導必需元件，因此，BpAP2可能具有多種生物學功能，參與復雜的植物發(fā)育過程。

2.3 白樺proBpAP2啟動子活性分析

2.3.1 proBpAP2在擬南芥中的轉錄活性

將構建好的pBI121-BpAP2::GUS融合表達載體及pBI121-35S::GUS在擬南芥中進行農桿菌侵染后，經GUS組織化學染色結果顯示，野生型擬南芥未著色，而被proBpAP2和35S啟動子驅動的GUS基因在轉基因擬南芥整株苗中均有轉錄活性(圖3A)，35S啟動子驅動的GUS片段轉化后著色程度比proBpAP2更深，說明proBpAP2啟動子可在擬南芥多種組織中驅動轉錄。另外，proBpAP2在花器官如花瓣、雄蕊和心皮中均有轉錄活性(圖3C)，在柱頭、心皮底端與花柄連接處著色更深，花藥和花絲的著色程度基本一致(圖3D)，在角果維管組織中也有較深著色(圖3E)?？梢?，白樺BpAP2基因可能參與營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育。

2.3.2 proBpAP2在白樺中的轉錄活性

為進一步驗證proBpAP2在同源表達系統中的活性，將其進行白樺轉化，野生型未著色，而被35S和proBpAP2啟動子驅動的GUS基因在轉基因白樺葉片中均有表達，但在proBpAP2驅動下在葉脈處著色更明顯，說明proBpAP2啟動子在同源表達系統中同樣具有一定程度的啟動活性。另外，對白樺組培苗的腋芽、根、莖進行了轉化和活性分析，發(fā)現在整個根部的顏色都較深(圖3G)，在腋芽頂部著色較深，(圖3F)，在莖中著色較淺(圖3H)。除了營養(yǎng)器官，在花器官和果實中也有一定轉錄活性。在種翅、退化的柱頭頂端(圖I)和雌花花柄(圖J)中的著色較深，而在成熟花藥中則很低(圖K)。以上結果進一步證明，白樺AP2基因啟動子proBpAP2在營養(yǎng)器官和生殖器官中都具有一定活性。

表1 proBpAP2啟動子序列元件分析Table 1 Analysis of proBpAP2 promoter sequence elements

圖3 proBpAP2在擬南芥和白樺中的活性分析 A.擬南芥；B.白樺葉片；C～E.擬南芥組織。C.花；D.雌蕊；E.角果；F～K.白樺組織。F.腋芽；G.根；H.莖段；I.雌花翅果；J.雌花花柄；K(i/ii).花藥Fig.3 Activity analysis of proBpAP2 in A.thaliana and B.platyphylla A. A.thaliana; B. B.platyphylla leaves; C-E. A.thaliana tissues(C. Flower; D. Pistil; E. Silique); F-K. B.platyphylla tissues(F. Axillary bud; G. Root; H. Stem segment; I. Samara of female flower; J. Floral shoot of female flower; K(i/ii). Anther)

圖4 BpAP2基因序列 起始密碼子和終止密碼子Fig.4 The sequence of the BpAP2 indicates the start codon and the stop codon

3 討論

高等植物的開花過程受到光周期途徑、春化途徑、自主調節(jié)途徑、GA途徑和年齡途徑這五種開花途徑調控。轉錄因子AP2和SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)與miR172共同作用，參與年齡調控途徑[16～18]。在本研究的白樺AP2啟動子GUS活性檢測過程中發(fā)現，衰老葉片不易染色(未附圖)，這與相關文獻中描述的AP2基因會隨植物年齡的增長而表達量下降相似[19]。proBpAP2驅動的GUS基因在萼片、花瓣以及雌、雄蕊中均表達，說明BpAP2基因可能不僅參與前兩輪花器官的發(fā)育[20～23]，也影響第三、四輪花器官的發(fā)育及開花時間[5,22]。而在擬南芥角果中的表達說明該基因可能與種子的發(fā)育也息息相關[24]。張妍等研究表明[25]，AP2基因在白樺的莖、葉、花序中都有表達，這與本實驗中proBpAP2在白樺雌花、葉、莖等組織中表達的結果一致。另外，proBpAP2在白樺的成熟花藥中的啟動活性較低，不同于在擬南芥中的異源轉化，因此，還需進一步深入驗證。

基因特異啟動子對于基因功能的分析非常重要，白樺AP2基因啟動子具有高等植物啟動子的典型特征，能驅動GUS基因在轉基因白樺和擬南芥中特異表達。該序列除了具有TATA-box、CAAT-box等真核生物的基本轉錄起始元件，還包括多種光響應元件、參與各種激素調節(jié)的元件以及與植物生長發(fā)育有關的元件如參與分生組織表達的CAT-box，胚乳表達的GCN4、Skn-1等，可見該啟動子元件具有豐富的多樣性，可能涉及多種生長發(fā)育和激素響應過程，為后續(xù)構建外源基因的高效表達載體提供了重要的表達元件參考，也為進一步研究BpAP2在白樺中的表達特點和功能機理奠定了基礎。此外,該啟動子下游所包含的5′UTR區(qū)，對基因的表達調控也起著重要作用[26～29]。

4 結論

本研究克隆了白樺AP2基因啟動子，命名為proBpAP2，其序列中存在大量的光響應元件、激素響應元件和低溫響應元件等。該啟動子在同源表達系統和異源表達系統中都具有表達活性，在擬南芥和白樺的營養(yǎng)器官和生殖器官中均有不同程度的轉錄活性，為后續(xù)進一步研究AP2基因在白樺花發(fā)育和營養(yǎng)生長中的作用、白樺退化花器官的形成機制以及縮短白樺生殖發(fā)育時間和改良白樺的遺傳育種奠定了基礎，并為提高或改進外源基因在不同表達系統中的表達效率提供可能。