劉玉萍 呂 婷 朱 迪 周勇輝 劉 濤 蘇 旭*

(1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008； 2.青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008； 3.青海省自然地理與環(huán)境過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008； 4.青藏高原環(huán)境與資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008)

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，是一種半自主復(fù)制的細(xì)胞器，擁有自身獨(dú)立的基因組。葉綠體基因組具有單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，大小介于120～180 kB，一般為共價(jià)閉合的環(huán)狀四組分結(jié)構(gòu)[1～2]，由一個(gè)長(zhǎng)單拷貝區(qū)(the large single copy，LSC)、一個(gè)短單拷貝區(qū)(the small single copy，SSC)及兩個(gè)反向重復(fù)序列(inverted repeat，IR)組成，這種分子形狀是近年來(lái)植物生物學(xué)領(lǐng)域研究探討的熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。葉綠體基因組雖然沒(méi)有核基因組包含的信息量多，但其結(jié)構(gòu)和序列組成高度保守并具有較低的進(jìn)化率，為植物分類、系統(tǒng)發(fā)育和物種界定等提供了不可或缺的遺傳信息，因而被認(rèn)為是研究植物條形碼最有潛力的基因序列，特別是在揭示物種進(jìn)化以及不同物種間親緣關(guān)系等方面也具有十分重要的價(jià)值，所以當(dāng)前它已被廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)進(jìn)化、DNA條形碼分析以及物種界定[4～6]。1986年煙草(Nicotianatabacum)[7]和地錢(Marchantiapolymorpha)[8]的葉綠體基因組全序列測(cè)序完成，這是最早被報(bào)道測(cè)序成功的葉綠體全基因組序列。嗣后，隨著分子生物學(xué)，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的興起及不斷地迅速發(fā)展，對(duì)植物葉綠體基因組的研究日益深入，使得植物基因組學(xué)研究發(fā)展到前所未有的新階段，成為植物系統(tǒng)基因組學(xué)和超級(jí)條形碼研究的熱點(diǎn)，諸多重要經(jīng)濟(jì)作物如水稻(Oryzasativa)[9]、玉米(Zeamays)[10]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[11]、小麥(Triticumaestivum)[12]、大麥(Hordeumvulgare)[13]和高粱(Sorghumbicolor)[13]等的葉綠體全基因組也被完整測(cè)序，葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得以迅速增加。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2011年5月，僅在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的完整葉綠體基因組的物種達(dá)到213個(gè)，其中高等植物葉綠體基因組有183個(gè)。然而，從調(diào)查的情況和先前報(bào)道的資料來(lái)看，未見國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)禾本科雀麥族植物進(jìn)行過(guò)任何葉綠體基因組的研究報(bào)道，目前該族植物葉綠體基因組的研究尚屬空白。根據(jù)我們多年的野外考察和前期研究發(fā)現(xiàn)藏扇穗茅是進(jìn)行這一研究的最佳代表。

藏扇穗茅(Littledaleatibetica)是禾本科(Poaceae)雀麥族(Bromeae)的一個(gè)多年生高山特有疏叢短根莖禾草，主要分布于青藏高原及其毗鄰的高山地區(qū)[14]，具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒、耐堿、耐貧瘠及抗病和抗風(fēng)沙能力。同時(shí)，藏扇穗茅不僅植物體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，而且花序相對(duì)粗長(zhǎng)、穗多粒大，加之抗逆性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，因而它現(xiàn)已成為農(nóng)牧業(yè)禾草良種繁育的一種重要基因資源。藏扇穗茅是1896年Hooker[15]建立扇穗茅屬時(shí)的一個(gè)模式種。自該屬建立以來(lái)，中國(guó)學(xué)者耿以禮[16]于1959年對(duì)藏扇穗茅進(jìn)行了正式描述，嗣后Tzvelev[17]進(jìn)一步證實(shí)了藏扇穗茅和寡穗茅的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。至此，國(guó)內(nèi)外未見對(duì)藏扇穗茅進(jìn)行過(guò)任何植物分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道，因而它的諸多科學(xué)問(wèn)題亟待解決。此外，藏扇穗茅也是青藏高原一個(gè)重要的高寒草原類型，特別是這些草原分布區(qū)是國(guó)家一、二類高原珍稀瀕危保護(hù)動(dòng)物如野牦牛(Bosmutus)、藏野驢(Equuskiang)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、棕熊(Ursusarctos)、盤羊(Argalisheep)等有蹄類動(dòng)物密度最高、最主要的活動(dòng)區(qū)之一[18]，顯然對(duì)藏扇穗茅開展葉綠體基因組方面的研究，對(duì)于揭示藏扇穗茅草原的結(jié)構(gòu)、分布與環(huán)境的分子機(jī)制必將具有十分重要的實(shí)際意義。據(jù)此，本文以青藏高原特有種—藏扇穗茅為研究對(duì)象，以黑麥草(Loliumperenne)葉綠體基因組為參考，通過(guò)對(duì)其葉綠體基因組的組裝、分析以及近緣物種系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，探討藏扇穗茅葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)位置關(guān)系，以期為藏扇穗茅葉綠體基因的表達(dá)調(diào)控提供理論依據(jù)，為其今后種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用和系統(tǒng)地位的確立提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藏扇穗茅(L.tibetica)新鮮幼嫩、無(wú)病蟲害葉片采自青海省格爾木市五道梁(N34°42′1.6″，E92°54′15.4″'，alt.4 865 m)，野外采摘后立即置于變性硅膠中快速干燥，用于總DNA的提取，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取和純化

首先采用改良的CTAB法[19]從硅膠干燥的藏扇穗茅葉片中提取基因組DNA，然后利用NanoDrop2000微量分光光度計(jì)和TBS-380分別檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量，最后采用Invitrogen生化DNA產(chǎn)物純化試劑盒(Purelink Genomic DNA Kit)對(duì)所提取的基因組DNA純化直到符合高通量測(cè)序要求為止。

1.2.2 基因組DNA掃描測(cè)序

利用Covaris M220高性能樣品處理系統(tǒng)(Covaris，Woburn，MA，USA)將純化后的雙鏈基因組DNA隨機(jī)打斷成400～500 bp的小片段，然后連接至建庫(kù)載體上構(gòu)建基因組雙末端(Paired-end，PE)測(cè)序文庫(kù)(DNA文庫(kù)制備試劑盒TruSeqTMDNA Sample Prep Kit，Illumina公司產(chǎn)品)，接著經(jīng)橋式PCR使文庫(kù)瞄定在測(cè)序芯片上并產(chǎn)生DNA簇，最后采用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina Hiseq 4000(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)對(duì)其進(jìn)行掃描測(cè)序，獲得模板DNA片段序列(原始數(shù)據(jù))。

1.2.3 葉綠體基因組組裝和注釋

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)raw reads利用Trimmomatic v0.33軟件[20]過(guò)濾去除接頭序列和低質(zhì)量序列后得到clean reads；然后再用Velvet軟件[21]進(jìn)行denovo組裝，以黑麥草(Loliumperenne，NC009950)作為參考序列，將拼接的contigs進(jìn)行定位，結(jié)合使用Phred-Phrap-Consed[22～23]確定contig的方向完成葉綠體基因組序列組裝；接著，應(yīng)用Geneious v10.0.5軟件進(jìn)行藏扇穗茅與黑麥草葉綠體基因組序列的CLUSTAL比對(duì)，同時(shí)進(jìn)行堿基修正，修改蛋白質(zhì)、tRNA、rRNA等注釋，完成藏扇穗茅葉綠體基因組的區(qū)分；最后利用在線繪圖軟件OGDRAW[24](http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/cgi-bin/ogdraw.pl)對(duì)藏扇穗茅葉綠體基因組序列進(jìn)行物理圖譜繪制。

1.2.4 藏扇穗茅及其近緣物種系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以香蒲科(Typhaceae)寬葉香蒲(Typhalatifolia)為外類群，藏扇穗茅及其所屬同科的30個(gè)物種共同來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹。即首先將所有參試物種葉綠體基因組序列用軟件Geneious v10.0.5中MAFFT[25]進(jìn)行比對(duì)并加以手工校正，然后用PAUP*4.0b10軟件[26]進(jìn)行最大簡(jiǎn)約性(Maximum Parsimony，MP)分析并構(gòu)建MP樹；同時(shí)，采用Modeltest 3.7軟件進(jìn)行建樹模型選擇，以RAxML軟件[27]進(jìn)行最大似然法(Maximum Likelihood，ML)分析并構(gòu)建ML樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏扇穗茅葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、分類、功能及特征

研究結(jié)果表明，藏扇穗茅葉綠體基因組序列全長(zhǎng)136 852 bp，呈典型的四段式結(jié)構(gòu)(圖1)。其中，大單拷貝區(qū)(the large copy region，LSC)長(zhǎng)80 970 bp，小單拷貝區(qū)(the small copy region，SSC)長(zhǎng)12 876 bp，兩個(gè)反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)(inverted repeat，IR)分別長(zhǎng)21 503 bp；葉綠體基因組GC含量為38.5%，AT含量為61.5%，說(shuō)明有明顯的AT偏向性；LSC、SSC和IR區(qū)GC含量分別為36.5、32.6、44.2%，IR區(qū)GC含量明顯高于LSC和SSC區(qū)，這主要是由IR區(qū)含有4個(gè)高GC含量的rRNA基因所導(dǎo)致(表1)。

表1 藏扇穗茅葉綠體基因組堿基組成Table 1 Base composition of the chloroplast genome in L.tibetica

藏扇穗茅葉綠體基因組共編碼141個(gè)基因，包括95個(gè)蛋白編碼基因、38個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因(圖1)。其中，LSC區(qū)編碼89個(gè)基因，包含68個(gè)蛋白編碼基因和21個(gè)tRNA基因；SSC區(qū)編碼12個(gè)基因，包含11個(gè)蛋白編碼基因和1個(gè)tRNA基因；IRA區(qū)編碼19個(gè)基因，包含7個(gè)蛋白編碼基因、8個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因；IRB區(qū)編碼21個(gè)基因，包含9個(gè)蛋白編碼基因、8個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因(圖1)。

藏扇穗茅葉綠體基因組根據(jù)功能不同可以被劃分為3大類，即基因表達(dá)相關(guān)基因59個(gè)、光合作用相關(guān)基因44、開放閱讀框和其它蛋白編碼基因3個(gè)以及未知功能基因3個(gè)。同時(shí)，基因表達(dá)相關(guān)基因又可以被再劃分為6小類，其中數(shù)量最多的基因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)RNA基因，轉(zhuǎn)錄起始因子數(shù)量最少，僅有1個(gè)；在IR區(qū)共有41個(gè)基因，其中有36個(gè)參與基因表達(dá)；光合作用相關(guān)基因也可以被劃分為7小類，以光合系統(tǒng)基因數(shù)量最多(表2)。

表2 藏扇穗茅葉綠體基因組編碼的基因類別Table 2 The gene category of the chloroplast genome in L.tibetica

圖1 藏扇穗茅葉綠體基因組環(huán)形圖譜 外圈內(nèi)側(cè)表示基因順時(shí)針轉(zhuǎn)錄，外圈外側(cè)表示基因逆時(shí)針轉(zhuǎn)錄；不同功能基因以不同顏色顯示；LSC和SSC分別表示長(zhǎng)重復(fù)區(qū)域和短重復(fù)區(qū)域；IRA和IRB表示反向重復(fù)區(qū)域；內(nèi)圈深色部分表示基因組平均GC含量，內(nèi)圈淺色部分表示基因組平均AT含量。Fig.1 Circularized map of the chloroplast genome of L.tibetica Genes drawn inside the circle are transcribed clockwise,and those outside are counterclockwise. Genes belonging to different functional groups are color-coded,and the locations of the LSC,SSC,IRA and IRB regions are indicated. The darker gray in the inner circle corresponds to GC content,whereas the lighter gray corresponds to AT content.

圖2 基于32個(gè)葉綠體基因組構(gòu)建的最大似然樹和最大簡(jiǎn)約樹 每個(gè)分支節(jié)點(diǎn)旁邊的數(shù)字表示靴帶支持率；“★”代表該分支節(jié)點(diǎn)的靴帶支持率為100%Fig.2 Maximum likelihood and parsimony phylogenetic tree based on 32 complete chloroplast genomes from Poaceae and an outgroup The number on each node indicates the bootstrap value, and “★” represents nodes with 100% BP.

2.2 藏扇穗茅與禾本科近緣物種間系統(tǒng)發(fā)育分析

以香蒲科(Typhaceae)寬葉香蒲(Typhalatifolia)為外類群，基于本研究測(cè)序得到的藏扇穗茅葉綠體基因組，與之前已發(fā)表的禾本科物種30個(gè)葉綠體基因組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，結(jié)果表明MP分析產(chǎn)生一個(gè)最簡(jiǎn)約系統(tǒng)樹，步長(zhǎng)(length)為82，一致性指數(shù)(consistency index，CI)和維持性指數(shù)(retention index，RI)分別為0.952和0.967；序列在選擇最大似然法運(yùn)行時(shí)，其最佳模型是GTR+G+I，并且最大簡(jiǎn)約法和最大似然法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全相同，只是極個(gè)別進(jìn)化節(jié)點(diǎn)上支持率略有不同，其均能清晰地反映物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，系統(tǒng)親緣關(guān)系樹如圖2所示。禾本科所有物種聚成一個(gè)單系分支(BV=100%)，同時(shí)分支內(nèi)又再次嚴(yán)格地形成四個(gè)大的分支，所有分支在兩種系統(tǒng)發(fā)育分析中均得到100%的BV值。即系統(tǒng)發(fā)育樹最基部分支僅由三芒草亞科(Anomochlooideae)的Anomochloamarantoidea所構(gòu)成，緊鄰其上的分支則是由來(lái)自黍亞科(Panicoideae)中狗尾草屬(Setaria)、蜀屬(Zea)、高粱屬(Sorghum)和甘蔗屬(Saccharum)的參試物種以及畫眉草亞科(Eragrostoideae)中畫眉草屬(Eragrostis)的參試物種所組成，稍靠系統(tǒng)發(fā)育樹頂端的分支則全部是由來(lái)自稻亞科(Oryzoideae)中稻屬(Oryza)和茭白屬(Zizania)的參試物種構(gòu)成，而系統(tǒng)發(fā)育最頂端的分支則是由早熟禾亞科(Pooideae)中小麥族(Triticeae)的小麥屬(Triticum)、山羊草屬(Aegilops)、大麥屬(Hordeum)和黑麥屬(Secale)物種，短柄草屬(Brachypodium)物種，黑麥草屬(Lolium)物種以及本研究所測(cè)物種—藏扇穗茅(L.tibetica)所組成，并且藏扇穗茅與小麥族所有參試類群形成一個(gè)姊妹群，在兩種系統(tǒng)發(fā)育分析中均得到100%的BV值(圖2)。

3 討論

葉綠體是高等綠色植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，擁有獨(dú)立完整且高度保守的基因組，絕大多數(shù)為母系遺傳。自1986年首次獲得地錢(Marchantiapolymorpha)葉綠體基因組的完整序列以來(lái)[8]，植物葉綠體全基因組的研究引起國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者的極大關(guān)注，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)進(jìn)化、物種界定、物種形成、遺傳多樣性以及葉綠體遺傳工程改造等領(lǐng)域。然而，當(dāng)時(shí)由于受測(cè)序技術(shù)和測(cè)序成本的限制，植物葉綠體全基因組研究進(jìn)展緩慢，僅有50多個(gè)葉綠體基因組完整序列得到報(bào)道。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展和測(cè)序成本的顯著降低，植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得以迅速充實(shí)，并且研究熱點(diǎn)主要集中于葉綠體全基因組的測(cè)序、近緣物種間葉綠體基因組序列比對(duì)以及物種間比較基因組學(xué)研究，這使得人們對(duì)葉綠體的認(rèn)識(shí)越來(lái)越清晰。從先前諸多研究報(bào)道來(lái)看，植物葉綠體全基因組研究主要涉及與人類生活密切相關(guān)的重要糧食作物如水稻(Oryzasativa)[9]、小麥(Triticumaestivum)[12]、玉米(Zeamays)[10]、高粱(Sorghumbicolor)[13]等，以及一些重要的藥用植物如丹參(Salviamiltiorrhiza)[28]、鼠尾草(Salviajaponica)[29]等。然而，目前禾本科中非經(jīng)濟(jì)作物的葉綠體全基因組序列測(cè)定相對(duì)較少，這在一定程度上制約了對(duì)禾本科植物在生態(tài)上及進(jìn)化上重要地位的全面認(rèn)識(shí)和理解，尤其是禾本科中雀麥族物種的葉綠體全基因組序列至今未見報(bào)道，從而嚴(yán)重影響了禾本科內(nèi)部諸多類群系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的全面分析。因此，我們采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，首次對(duì)青藏高原特有種—藏扇穗茅進(jìn)行了葉綠體全基因組的測(cè)序，并建立了標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)序流程。

藏扇穗茅不僅是扇穗茅屬的一個(gè)模式種，而且也是該屬中具有較大生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種。因此，本文對(duì)藏扇穗茅葉綠體全基因組的完整測(cè)序和系統(tǒng)分析，勢(shì)必可為以后探討雀麥族在整個(gè)禾本科中的系統(tǒng)位置和進(jìn)化歷史提供重要依據(jù)。本研究結(jié)果表明，藏扇穗茅葉綠體全基因組大小為136 852 bp，其完全隸屬于已報(bào)道的被子植物葉綠體全基因組大小范圍之內(nèi)[30]，也是由一對(duì)反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)分隔成一個(gè)大單拷貝區(qū)和一個(gè)小單拷貝區(qū)，呈典型的四段式結(jié)構(gòu)，GC含量為38.5%，這與先前報(bào)道的其它禾本科物種的葉綠體基因組結(jié)果基本一致[31～32]。同時(shí)，藏扇穗茅葉綠體全基因組在基因種類、組成、順序及結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，與其它絕大多數(shù)禾本科物種基本相同，同樣可依據(jù)基因功能不同將其劃分為三大類：(1)與光合作用系統(tǒng)相關(guān)的基因；(2)與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯相關(guān)的基因；(3)其它及未知功能基因。然而，藏扇穗茅葉綠體基因組與其它禾本科物種葉綠體基因組之間也有許多差異存在，如藏扇穗茅擁有絕大多數(shù)禾本科其它物種缺失的完整ycf2基因、僅有16個(gè)基因存在內(nèi)含子等，這也許是由于它長(zhǎng)期處于青藏高原多種逆境生態(tài)環(huán)境因子脅迫的結(jié)果。此外，先前研究還表明，葉綠體基因組整體作為超級(jí)條形碼可以較好地用于植物物種鑒定[33]，尤其是對(duì)近緣物種鑒分[34]具有更為理想的效果。據(jù)此，本文采用葉綠體全基因組序列對(duì)藏扇穗茅及其同科的30個(gè)物種在基因組水平上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示最大簡(jiǎn)約法和最大似然法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全相同，只是極個(gè)別進(jìn)化節(jié)點(diǎn)上支持率略有不同，藏扇穗茅與小麥族所有參試類群形成一個(gè)姊妹群，在兩種系統(tǒng)發(fā)育分析中均得到100%的BV值，從而較粗略地確立了藏扇穗茅在整個(gè)禾本科物種中的系統(tǒng)位置和進(jìn)化關(guān)系，這也進(jìn)一步說(shuō)明葉綠體基因組在禾本科物種界定上具有較大潛力，為今后禾本科物種界定、物種分化、物種形成和遺傳多樣性研究提供了技術(shù)手段和重要借鑒?？傊?，本文利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)青藏高原特有種—藏扇穗茅葉綠體全基因組進(jìn)行測(cè)序，并組裝得到完整葉綠體基因組全序列，是首次對(duì)扇穗茅屬乃至整個(gè)雀麥族物種葉綠體基因組建成，這不僅為以后雀麥族種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)，而且也豐富了禾本科植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)而加深對(duì)禾本科物種界定和物種分化的認(rèn)識(shí)，從而對(duì)青藏高原生態(tài)恢復(fù)和野生牧草利用帶來(lái)直接效益。