陳 晨 邢寶月 邊秀艷 許思佳 劉桂豐 姜 靜

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

CUC基因，也叫做CUP-SHAPEDCOTYLEDON，屬于植物特異NAC超家族轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors)，在植物的頂端分生組織(shoot apical meristem，SAM)起始與維持、器官邊界形成等多方面發(fā)揮重要的作用[1～2]，還能夠影響側(cè)枝發(fā)育[3～4]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，共發(fā)現(xiàn)3個AtCUC基因，分別為AtCUC1、AtCUC2、AtCUC3。AtCUC1和AtCUC2在不同的芽器官原基及子葉的邊界處表達，雙突變體cuc1/cuc2導(dǎo)致子葉邊界的異位組織生長、器官的融合，以及頂端分生組織SAM的缺失和杯狀子葉的產(chǎn)生[1,5～7]，cuc2/cuc3雙突變體在胚珠分離方面有缺陷[8～9]，另外，AtCUC3受到AtCUC1和AtCUC2的調(diào)控[10]。據(jù)報道，AtCUC1和AtCUC2的表達也受到生長素信號途徑基因、KNOX的調(diào)控[11～13]。Rossmann等[14]等在番茄中發(fā)現(xiàn)，LeCUC基因?qū)Ψ?LycopersiconesculentumMiller)小葉腋芽的形成至關(guān)重要。Bilsborough等[15]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，過表達AtCUC2基因使葉片邊緣鋸齒加劇，AtPIN1基因與AtCUC2基因相互作用，協(xié)同影響生長素在葉緣位置的濃度梯度，從而形成多樣的葉邊緣形態(tài)。

本研究團隊采用Illumina技術(shù)開展了歐洲白樺(Betulapendula)及其變種裂葉樺(B.pendula‘Dalecarlica’)的轉(zhuǎn)錄組分析，測序結(jié)果顯示，有8 767個unigene上調(diào)表達、8 379個unigene下調(diào)表達，并在生長素的運輸及作用途徑發(fā)生了明顯變化[16]。其中，裂葉樺的BpCUC2、BpPINs基因呈現(xiàn)上調(diào)表達，同時也發(fā)現(xiàn)一條具有廻文結(jié)構(gòu)的BpCUC2基因(命名為BpCUCt)，擬南芥AtCUC2是植物NAC超家族轉(zhuǎn)錄因子之一，在生長素極性運輸過程中，AtCUC2可以促進AtPIN的極性定位。正是由于AtPIN、生長素和AtCUC2三者的協(xié)同作用，保證了植物葉緣不同部位生長素濃度的差異，從而使葉緣產(chǎn)生缺刻[15,17]。為了明確BpCUCt的功能，本實驗分別構(gòu)建了BpCUC2啟動子及35S啟動子驅(qū)動的BpCUCt載體，以白樺合子胚為受體開展轉(zhuǎn)基因研究，觀察轉(zhuǎn)基因株系表型變化，并測定轉(zhuǎn)基因株系的內(nèi)源激素IAA含量，進而揭示BpCUCt的分子功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的轉(zhuǎn)基因受體為白樺種子，采自東北林業(yè)大學(xué)白樺種子強化園。

1.2 方法

1.2.1 白樺BpCUCt序列分析

利用BioEdit和DNAMAN軟件對白樺BpCUCt和白樺BpCUC2基因進行序列比對，同時利用NCBI網(wǎng)站的Conserved domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測BpCUCt基因的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 白樺BpCUCt基因克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的白樺BpCUCt序列，由金唯智生物試劑公司合成該基因。以合成的BpCUCt序列為模板，進行重疊延伸PCR擴增，由于其特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)分別設(shè)計兩對引物進行拼接，并分別在第一對引物的上游和第二對引物的下游添加保護堿基和酶切位點，引物序列見表1。其反應(yīng)體系如下：10×Pfu Buffer 2 μL，dNTPs(25 mmol·L-1)1.6 μL，模板2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Pfu DNA聚合酶1 U，無菌水補齊至20 μL。PCR擴增程序如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 白樺BpCUCt基因重疊延伸PCR擴增引物Table 1 Overlap extension PCR primer sequence of BpCUCt

1.2.3 35S：：BpCUCt載體構(gòu)建

分別以上述PCR產(chǎn)物和pROKII載體質(zhì)粒為模板，利用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切反應(yīng)體系參考徐煥文[2]。酶切產(chǎn)物膠回收后利用T4DNA ligase連接，連接反應(yīng)體系參考黃海嬌等[18]，將連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans5α感受態(tài)[19]，卡那霉素篩選后，挑單菌落進行PCR檢測，并將質(zhì)粒送至生物試劑公司測序，重組質(zhì)粒命名為35S：：BpCUCt(圖1:A),再利用三親交配法[20]將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌獲得EHA105(35S：：BpCUCt)工程菌。

1.2.4 ProCUC2::BpCUCt載體構(gòu)建

以白樺DNA為模板，PCR擴增BpCUC2基因啟動子序列，反應(yīng)體系及引物序列參考劉超逸，并在引物序列的5、端加上保護堿基和酶切位點，酶切位點為HindⅢ和XbaⅠ，引物序列見表2。分別以重組質(zhì)粒35S：：BpCUCt和BpCUC2啟動子PCR產(chǎn)物為模板，利用HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收及連接同上，獲得重組質(zhì)粒命名為ProCUC2：：BpCUCt(圖1:B),進而轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌獲得EHA105(ProCUC2：：BpCUCt)工程菌。

圖1 載體構(gòu)建示意圖 A. 35S：：BpCUCt載體構(gòu)建；B. ProCUC2：：BpCUCt載體構(gòu)建Fig.1 Diagram of the vector A. Diagram of the 35S：：BpCUCt vector；B. Diagram of the ProCUC2：：BpCUCt vector

表2 白樺BpCUC2基因啟動子序列擴增引物Table 2 PCR primer sequence of BpCUC2 promoter

1.2.5 白樺的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白樺合子胚法進行遺傳轉(zhuǎn)化，在80 mg·L-1的kan抗生素篩選條件下，分別獲得2個35S：：BpCUCt和4個ProCUC2：：BpCUCt抗性愈傷組織，再分別將抗性愈傷組織接種至WPM+0.02 mg·L-1NAA+0.8 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3+80 mg·L-1kan+200 mg·L-1頭孢霉素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，進而獲得叢生繼代苗，WPM+0.4 mg·L-1IBA的固體培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，20 d后，按照組培微繁技術(shù)[21]移入溫室繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因白樺的PCR檢測

分別以轉(zhuǎn)基因白樺及對照白樺從頂端數(shù)起第3片葉為材料，提取DNA并PCR擴增白樺BpCUCt基因片段，引物序列見表1，反應(yīng)體系及擴增程序同1.2.1。將獲得的PCR產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因白樺的qRT-PCR檢測

分別以轉(zhuǎn)基因白樺及對照白樺從頂端數(shù)起第3片葉為材料，提取總RNA并進行qRT-PCR，引物序列見表3。反應(yīng)體系和程序根據(jù)黃海嬌等[17]方法，進行BpCUCt基因的qRT-PCR，根據(jù)公式XN=2-ΔΔCt計算外源基因的相對表達量。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因白樺葉片形態(tài)調(diào)查

2017年8月15日，選取2年生轉(zhuǎn)基因白樺及對照從頂端數(shù)起第4片功能葉，使用掃描儀CanoScan LiDE 210對葉片進行掃描，Image J軟件測量葉片的長、寬及葉面積，測量方法參考渠暢[16]。利用SPSS21進行F檢驗統(tǒng)計學(xué)分析。

表3 熒光實時定量PCR擴增引物序列Table 3 Primer sequence of the quantitative real-time PCR assay

1.2.9 轉(zhuǎn)基因白樺苗高生長特性

2017年5月初～9月初，每隔15天測量2年生轉(zhuǎn)基因白樺及對照的苗高，獲得數(shù)據(jù)后，采用excel 2010作圖。

1.2.10 內(nèi)源激素IAA測定

分別以轉(zhuǎn)基因白樺及對照白樺從頂端數(shù)起第4片葉為材料，將所有材料均分成左葉(L)、葉脈(M)、右葉(R)三組分，其中pc-4株系葉片表型特殊，葉片出現(xiàn)左葉與右葉葉面積大小不對等，故將其左葉>右葉設(shè)置為pc-4A組，右葉>左葉設(shè)置為pc-4B組，見圖9(A、B)。植物激素提取方法參考姜晶[22]，并采用酶聯(lián)免疫吸附測定法進行內(nèi)源激素IAA測定[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpCUCt序列分析

利用BioEdit軟件進行BpCUCt和BpCUC2基因序列比對發(fā)現(xiàn)，二者具有相同的1 238 bp堿基片段，相似度達到了98.3%。利用NCBI網(wǎng)站的Conserved domain工具預(yù)測BpCUCt基因的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該基因在170～538 bp含有NAC超家族所特有的NAM(No apical meristem)結(jié)構(gòu)域(圖2)，其為典型的植物生長發(fā)育相關(guān)蛋白[24]。

圖2 BpCUCt的蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domains on BpCUCt

圖3 白樺BpCUCt基因克隆 A.白樺BpCUCt-1序列片段克隆(M. DL2000 Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1-6.BpCUCt-1基因片段；7.水對照)；B. 白樺BpCUCt-2序列片段克隆(M. DL2000 Marker；1.水對照；2～3.BpCUCt-2基因片段)；C.白樺BpCUCt序列全長克隆(M. DL2000Marker；1.水對照；2.白樺BpCUCt基因片段)Fig.3 BpCUCt gene clone A. BpCUCt-1 gene fragment clone(M. DL2000 Marker(2 000，1 000，750，500，250，100bp)；1-6.BpCUCt-1 gene fragment; 7.Water control)；B. BpCUCt-2 gene fragment clone(M. DL2000 Marker; 1.Water control; 2-3.BpCUCt-2 gene fragment)；C. BpCUCt gene clone(M. DL2000 Marker; 1.Water control; 2.BpCUCt gene)

2.2 白樺BpCUCt基因克隆

以合成的BpCUCt序列為模板，進行重疊延伸PCR擴增，即分別設(shè)計兩對引物擴增，最終對兩段序列片段進行拼接。結(jié)果(圖3)表明，該擴增片段大小與目的條帶一致，說明該基因克隆成功。

2.3 轉(zhuǎn)基因載體的獲得

2.3.1 35S啟動子驅(qū)動的BpCUCt載體獲得

以合成的白樺BpCUCt基因為模板，利用設(shè)計的帶有PstⅠ、HindⅢ酶切位點的特異性引物PCR擴增該序列，分別雙酶切pROKII載體質(zhì)粒及擴增序列，經(jīng)T4連接酶連接，在50 mg·L-1卡那霉素抗性平板上篩選陽性重組質(zhì)粒，對陽性質(zhì)粒35S：：BpCUCt測序后，通過BioEdit比對，確定獲得了35S啟動子驅(qū)動的BpCUCt植物表達載體(圖4:A)。

2.3.2BpCUC2基因啟動子驅(qū)動的BpCUCt載體獲得

在獲得35S：：BpCUCt載體基礎(chǔ)上，利用設(shè)計的帶有HindⅢ和XbaⅠ酶切位點的特異性引物PCR擴增BpCUC2基因啟動子序列，采用HindⅢ和XbaⅠ酶切35S：：BpCUCt載體，膠回收帶有BpCUCt及載體片段，同時將擴增序列也用PstⅠ、HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，在50 mg·L-1卡那霉素抗性平板上篩選陽性重組質(zhì)粒，PCR檢測后確認獲得ProCUC2::BpCUCt植物表達載體構(gòu)建(圖4:B)。

2.4 轉(zhuǎn)基因白樺的獲得

分別用EHA105(35S：：BpCUCt)和EHA105(ProCUC2：：BpCUCt)工程菌侵染白樺成熟種子，經(jīng)菌液PCR鑒定后(圖5)，進行共培養(yǎng)(WPM+0.8 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA)，在選擇培養(yǎng)基上(WPM+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+80 mg·L-1卡那霉素+200 mg·L-1頭孢霉素)進行篩選培養(yǎng)，20～30 d后合子胚傷口處陸續(xù)出現(xiàn)抗性愈傷組織，將其切下更換分化培養(yǎng)基(WPM+0.8 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1GA3)繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右即可獲得抗性不定芽，挑取生長狀態(tài)良好的不定芽單株剪切移入生根培養(yǎng)基(WPM+0.4 mg·L-1IBA)中進行生根培養(yǎng)。本實驗共計獲得2個35S：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因白樺株系，分別將其命名為35S-1、35S-2，同時獲得4個ProCUC2：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因白樺，分別將其命名為pc-1、pc-2、pc-3、pc-4，35S：：BpCUCt和ProCUC2：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因獲得過程分別如圖6～7。

圖4 BpCUCt載體構(gòu)建PCR檢測電泳圖譜 A.35S：：BpCUCt載體構(gòu)建PCR檢測圖(M. DL2000 Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1.陽性對照；2.水對照；3～6. 35S：：BpCUCt重組質(zhì)粒)；B.ProCUC2：：BpCUCt載體構(gòu)建PCR檢測圖(M. DL2000 Marker；1.陽性對照；2.水對照；3～5. ProCUC2：：BpCUCt重組質(zhì)粒Fig.4 PCR electrophoretic patterns of vector construction of BpCUCt A.Vector Construction of 35S：：BpCUCt(M. DL2000 Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1.Positive control；2.Water control；3-6.Recombinant plasmid of 35S：：BpCUCt)； B.Vector Construction of ProCUC2：：BpCUCt (M. DL2000 Marker；1.Positive control；2.Water control；3-5.Recombinant plasmid of ProCUC2：：BpCUCt)

圖5 BpCUCt農(nóng)桿菌菌液PCR檢測 A.EHA105(35S：：BpCUCt)PCR電泳檢測圖(M. DL2000 Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1. 35S：：BpCUCt質(zhì)粒；2.水對照；3～4. 35S：：BpCUCt農(nóng)桿菌菌液)；B. EHA105(ProCUC2：：BpCUCt)PCR檢測圖(M. DL2000 Marker；1.ProCUC2：：BpCUCt質(zhì)粒；2.水對照； 3～5.ProCUC2：：BpCUCt農(nóng)桿菌菌液)Fig.5 Agrobacterium identification of recombinant plasmid of BpCUCt by PCR A. PCR Electrophoretic Patterns of EHA105(35S：：BpCUCt)(M. DL2000 Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1.Recombinant plasmid of 35S：：BpCUCt；2.Water control；3-4.Agrobacterium of 35S：：BpCUCt)；B.PCR Electrophoretic Patterns of EHA105(ProCUC2：：BpCUCt)(M. DL2000 Marker；1. ecombinant plasmid of ProCUC2：：BpCUCt；2.Water control；3-5.Agrobacterium of ProCUC2：：BpCUCt)

圖6 轉(zhuǎn)35S：：BpCUCt白樺株系的獲得 A.含有35S：：BpCUCt農(nóng)桿菌侵染白樺種子；B～C.抗性愈傷組織；D.抗性繼代苗；E.組培生根苗；F.移栽苗Fig.6 Regeneration of 35S：：BpCUCt transgenic lines A.Agrobacterium of 35S：：BpCUCt infected white birch seeds；B-C.Resistant callus；D.Resistance propagation seedlings；E.Rooted seedlings；F.Transplant seedlings

圖7 轉(zhuǎn)ProCUC2：：BpCUCt白樺株系的獲得 A.含有ProCUC2：：BpCUCt農(nóng)桿菌侵染白樺種子；B～C.抗性愈傷組織；D.抗性繼代苗；E.組培生根苗；F.移栽苗Fig.7 Regeneration of ProCUC2：：BpCUCt transgenic lines A.Agrobacterium of ProCUC2：：BpCUCt infected white birch seeds；B-C.Resistant callus；D.Resistance propagation seedlings；E.Rooted seedlings；F.Transplant seedlings

圖8 白樺轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測電泳圖譜及熒光定量檢測 A.轉(zhuǎn)35S：：BpCUCt白樺株系PCR檢測(M.DL2000 DNA Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1.陰性對照；2.陽性對照；3.WT；4～5.目的基因)；B.轉(zhuǎn)ProCUC2：：BpCUCt白樺株系PCR檢測(M.DL2 000 DNA Marker (2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；1.陽性對照；2.陰性對照；3.WT；4～7.目的基因)；C.轉(zhuǎn)基因白樺實時熒光定量RT-PCRFig.8 35S：：BpCUCt gene transgenic birch PCR detection and qRT-PCR detection A. 35S：：BpCUCt gene transgenic birch PCR detection(M.DL2000Marker(2 000，1 000，750，500，250，100 bp); 1.Plasmid control; 2.Negative control; 3.Water control; 4-5.Transgenic lines)；B. 35S：：BpCUCt gene transgenic birch PCR detection(M. DL2000Marker; 1.Plasmid control；2-3.Negative control；3.Water control；4-7.Transgenic lines)；C.Expression analysis determined by qRT-PCR in BpCUCt transgenic lines

2.5 轉(zhuǎn)基因株系的PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測

分別以轉(zhuǎn)基因白樺35s-1、35s-2、pc-1、pc-2、pc-3、pc-4及對照白樺從頂端數(shù)起第3片葉為材料，提取總DNA，進行PCR檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系及陽性質(zhì)粒在1 206 bp處均有明顯的擴增條帶，而水對照和WT均未見擴增譜帶(圖8:A～B)，初步證明BpCUCt基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入野生型白樺。

分別從頂端數(shù)起第3片葉提取上述轉(zhuǎn)基因株系及對照白樺總RNA，利用實時熒光定量PCR檢測白樺BpCUCt基因的表達量(圖8:C)，除pc-2株系外，相對WT株系其他5個轉(zhuǎn)基因株系的白樺BpCUCt表達量均顯著上調(diào)，尤其是35s-1株系，相對表達量是WT株系5.74倍。

2.6 轉(zhuǎn)基因白樺葉片形態(tài)的改變

對獲得的轉(zhuǎn)基因白樺觀察發(fā)現(xiàn)，在葉片形態(tài)及大小等性狀均與WT株系明顯不同，2個轉(zhuǎn)基因株系的葉片均呈現(xiàn)左右葉片不對稱狀態(tài)(圖9:A～B)，35s-1、35s-2等2個轉(zhuǎn)基因株系的葉長、葉寬以及葉面積等性狀均顯著大于WT，例如：35s-2株系的葉面積是WT的2倍。

pc-1、pc-2、pc-3、pc-4等4個轉(zhuǎn)基因株系在葉片大小方面與WT差異不顯著(圖9:G～I)，但在葉片形態(tài)方面變化較大。葉片邊緣齒裂較WT淺，葉片左右呈現(xiàn)明顯不對稱，葉基部向葉柄位置凸出(圖9:D)，并且pc-4轉(zhuǎn)基因株系具有多個SAM組織，主干與側(cè)枝相融合，無明顯區(qū)分(圖9:F)。

CUC2是植物的生長負調(diào)控因子，能夠抑制細胞分裂，減緩植物的生長，并且CUC2作用于植物多個部位，參與葉緣缺刻、鋸齒形成及SAM的形態(tài)建成等多個生長發(fā)育過，而上述結(jié)果恰好說明BpCUCt轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了與BpCUC2過表達植株相似的表型，繼而二者具有相似的功能。

2.7 轉(zhuǎn)基因白樺苗高生長特性

將獲得的轉(zhuǎn)基因白樺及野生型對照于2016年擴繁后移栽至溫室，2017年早春開始調(diào)查苗高生長情況，結(jié)果顯示，2個35S啟動子驅(qū)動的BpCUCt轉(zhuǎn)基因白樺35s-1，35s-2在生長初期與WT并沒有表現(xiàn)出明顯的差異，進入8月后，苗高生長漸漸減緩，到了9月轉(zhuǎn)基因株系苗高均低于WT株系，其中35s-1株系顯著低于WT株系，此時苗高僅為WT的19.41%。

對4個BpCUC2啟動子驅(qū)動的BpCUCt轉(zhuǎn)基因白樺觀察發(fā)現(xiàn)，移栽當(dāng)年的轉(zhuǎn)基因苗木就表現(xiàn)出明顯的矮化現(xiàn)象，2個轉(zhuǎn)基因株系苗高均顯著低于WT(P<0.01)，為WT的69%，翌年5月開始每15 d調(diào)查參試株系的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT株系一直生長最快，尤其是pc-4株系苗高明顯矮化，生長也緩慢，到了9月其苗高不僅顯著低于WT，也顯著低于其他3個轉(zhuǎn)基因株系，此時的苗高低于WT的77%，低于3個轉(zhuǎn)基因株系均值的71%。

2.8 轉(zhuǎn)基因白樺節(jié)間距的變化

通過上述測量我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因白樺苗高產(chǎn)生了變化，因此繼而對照白樺的節(jié)間距進行了統(tǒng)計，結(jié)果如圖11所示：WT多數(shù)節(jié)間距在16～50 cm，而轉(zhuǎn)35S：：BpCUCtt和Pr-CUC2：：BpCUCt白樺的節(jié)間距多數(shù)落在40～60 cm，表明轉(zhuǎn)35S：：BpCUCt白樺的節(jié)間距變長；而P3白樺的節(jié)間距多數(shù)在6～10 cm，說明P3植株節(jié)間距變短，并且轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)枝要顯著少于WT。上述測量結(jié)果表明BpCUCt在影響植物縱向生長的同時，也導(dǎo)致節(jié)間距不同程度的改變，影響了側(cè)枝的生長。

2.8 轉(zhuǎn)基因白樺內(nèi)源IAA含量測定

由于CUC2基因在生長素極性運輸過程中起著至關(guān)重要的作用，為了弄清轉(zhuǎn)基因白樺葉片左右不對稱的原因，實驗分別測定葉脈、位于葉脈左側(cè)葉片及葉脈右側(cè)葉片等3部分組織的IAA含量，其中pc-4葉片由于其左右葉片不對稱生長，出現(xiàn)兩種差異的葉片，左側(cè)葉片明顯大于右側(cè)葉片或右側(cè)葉片大于左側(cè)葉片(圖12:A～B)，因此將其按照左右葉面積大小不同分成A、B兩組。左側(cè)葉片IAA含量分析發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因株系(除pc-2外)IAA含量均顯著高于WT株系，其中pc-4 A最高，是WT的28.41倍，其他轉(zhuǎn)基因株系間差異不顯著；右側(cè)葉片IAA含量分析發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因株系(pc-1株系除外)IAA含量顯著高于WT(P<0.01)，其中pc-4B的IAA含量最高，是WT的4.74倍，是pc-4 A的2.57倍；葉脈IAA含量分析發(fā)現(xiàn)：IAA含量均值為372.39 ng·g-1，高于葉片部位的含量，是葉片含量的3.7倍，轉(zhuǎn)基因株系間的IAA含量差異不顯著，只有pc-4的兩組葉脈含量顯著高于WT及其他轉(zhuǎn)基因株系，分別是WT的1.79和3.0倍。由此初步可見，BpCUCt基因能夠影響生長素含量的分布。

3 討論

現(xiàn)有的CUC2基因的研究多局限于擬南芥、水稻等模式植物中，主要在不同組織器官的形態(tài)建成及邊界確定中發(fā)揮重要的作用，然而有關(guān)白樺BpCUC2同源基因功能的報道還比較少。本實驗從白樺轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)BpCUC2基因的突變基因?qū)⑵涿麨锽pCUCt，構(gòu)建了35S：：BpCUCt和ProCUC2：：BpCUCt植物表達載體，獲得轉(zhuǎn)基因白樺株系。對其轉(zhuǎn)基因株系進行表型觀察和分析發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)白樺BpCUCt基因植株出現(xiàn)了與BpCUC2超表達株系相似的表型[2]植株矮化、生長緩慢、節(jié)間距不規(guī)則，側(cè)枝與主干出現(xiàn)不同程度的融合，并且ProCUC2：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因植株葉緣變平滑、左右葉大小不對稱等性狀，而35S：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因株系葉邊緣與野生型并無明顯區(qū)別，說明特異性啟動子ProCUC2比35S啟動子在葉緣形態(tài)發(fā)育中的作用更強，這與BpCUC2啟動子的研究結(jié)果一致[24～26]。該基因主要在頂端分生組織、器官的形態(tài)建成及邊界確定等多個方面影響植株的生長發(fā)育。

圖9 轉(zhuǎn)BpCUCt基因植株葉形態(tài)特征觀察 A.35S：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因株系表型觀察；B.ProCUC2：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因株系表型觀察；C～D.轉(zhuǎn)基因株系pc-4葉緣和SAM發(fā)生改變；E～F.轉(zhuǎn)基因株系pc-4主干和側(cè)枝融合；G～H.轉(zhuǎn)基因株系葉長、葉寬、葉面積的測量Fig.9 Leaf morphological characters in BpCUCt transgenic lines A. Phenotype of 35S：：BpCUCt transgenic lines; B. Phenotype of ProCUC2：：BpCUCt transgenic lines; C-D.Varied leaf margin and SAM of transgenic lines; E-F. Fusion of the main stem and lateral branches in transgenic line pc-4; G-H. Leaf length,leaf width,leaf area of transgenic lines and wild type

圖10 轉(zhuǎn)基因白樺苗高生長比較 A.轉(zhuǎn)基因株系及對照；B.35S：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因株系苗高測量；C.ProCUC2：：BpCUCt轉(zhuǎn)基因株系苗高測量Fig.10 Height of BpCUCt transgenic lines A.Transgenic lines and wild type; B.Height of 35S：：BpCUCt transgenic lines; C.Height of ProCUC2：：BpCUCt transgenic lines

圖11 轉(zhuǎn)基因白樺苗節(jié)間距比較及側(cè)枝個數(shù) A.轉(zhuǎn)基因株系及WT側(cè)枝情況；B.野生型白樺節(jié)間距長度統(tǒng)計；C～D.35S：：BpCUCt株系節(jié)間距長度統(tǒng)計；E～H. ProCUC2：：BpCUCt株系節(jié)間距長度統(tǒng)計 轉(zhuǎn)基因株系及WT同一節(jié)間距區(qū)間的方差分析及顯著性Fig.11 Knot distances and the lateral branch number of transgenic lines and wild type A.The lateral branch number of transgenic lines and wild type; B.Knot distances of wild type; C-D.Knot distances of 35S：：BpCUCt transgenic lines; E-F.Knot distances of ProCUC2：：BpCUCt transgenic lines Variance analysis and significance of the same knot distance interval in transgenic lines and WT

圖12 轉(zhuǎn)白樺BpCUCt基因IAA含量測定 A. pc-4A組葉；B. pc-4B組葉片(其中L為左葉，R為右葉，M為葉脈)；C.轉(zhuǎn)基因株系左葉生長素含量；D.轉(zhuǎn)基因株系右葉生長素含量；E.轉(zhuǎn)基因株系葉脈生長素含量Fig.12 Endogenous IAA content of BpCUCt transgenic lines A.Diagram of the leaf pc-4A; B.Diagram of the leaf pc-4B(there into,L represents the left leaf,R represents the right leaf,M represents the main vein); C.Endogenous IAA content of the left leaf; D.Endogenous IAA content of the right leaf; E.Endogenous IAA content of the main vein

Bilsborough等[14]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，抑制表達AtCUC2基因使葉緣鋸齒變淺，而鋸齒的產(chǎn)生，正是由于AtPIN1基因與AtCUC2基因的相互作用，協(xié)同影響生長素在葉緣位置的濃度梯度，從而形成多樣的葉邊緣形態(tài)。前人研究發(fā)現(xiàn)，生長素能夠調(diào)控植物器官的構(gòu)建，通過極性運輸?shù)姆绞娇刂破湓诓煌M織部位的含量[27～28]。測量轉(zhuǎn)基因白樺和WT左葉(L)、右葉(R)及葉脈(M)的內(nèi)源激素IAA含量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系(除pc-2外)左側(cè)葉片IAA含量均顯著高于WT株系；轉(zhuǎn)基因株系(pc-1株系除外)右側(cè)葉片IAA含量顯著高于WT；葉脈的形成對葉片的發(fā)育有直接的關(guān)系，支撐葉片的同時為葉片運輸營養(yǎng)物質(zhì)，葉脈也決定了植物株型的生長[29～30]。轉(zhuǎn)基因株系(pc-1株系除外)葉脈IAA含量均高于WT株系。說明過表達BpCUCt轉(zhuǎn)基因白樺造成葉片內(nèi)源激素含量發(fā)生改變，BpCUC2啟動子在白樺的不用組織部位對生長素有不同的響應(yīng)，證實該基因可能參與了激素的生物合成或信號傳導(dǎo)途徑[27]，上述結(jié)果可能也是轉(zhuǎn)白樺BpCUCt基因植株出現(xiàn)了與BpCUC2超表達株系相似的表型的原因。生長素信號通路由多種合成、應(yīng)答、運輸基因共同協(xié)作完成，而BpCUC2基因是否與上述基因相互作用，還需要進一步的研究。