嚴(yán)俊賢，李有寧，于 剛，吳開暢，馬振華，陳明強(qiáng)

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300 )

近年來(lái)，近海海域受到人類活動(dòng)的影響越來(lái)越大，海洋受到重金屬的污染也日益嚴(yán)重。重金屬能夠在生物體內(nèi)積蓄，沿食物鏈富集，威脅海洋生物生產(chǎn)以及人類食品安全[1-2]。銅(Cu)是海洋環(huán)境中最常見的重金屬污染物之一，金屬冶煉、機(jī)械制造、有機(jī)化工等均排放大量的含銅廢水。銅離子經(jīng)陸地水系遷移至海洋造成部分近海海域的銅含量偏高，危害海洋生物的生存[3]。銅是生物體所需的微量元素，參與多種酶的形成與反應(yīng)，但過(guò)量的銅與生物重要分子非特異性結(jié)合產(chǎn)生毒性，嚴(yán)重者導(dǎo)致DNA分子斷裂[4-6]，對(duì)生物幼體的危害尤大[7-8]。用于生產(chǎn)附殼珍珠的企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)是我國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)種類之一，在海南、廣東以及廣西海域大量養(yǎng)殖[9]。海洋雙殼貝類體表可吸收、吸附和攝食積累海洋中的重金屬，其抗氧化系統(tǒng)對(duì)重金屬的污染反應(yīng)靈敏，是監(jiān)測(cè)海域重金屬污染的重要物種[10-11]。目前，已利用紫貽貝(Mytilusedulis)體內(nèi)的生物標(biāo)志物對(duì)重金屬敏感的特點(diǎn)監(jiān)測(cè)海區(qū)的重金屬污染程度，早期預(yù)警環(huán)境污染[12-14]。生物體內(nèi)的抗氧化酶活性，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶等是重金屬污染的生物標(biāo)志之一，能夠反映重金屬污染物對(duì)機(jī)體的傷害程度，診斷環(huán)境中的重金屬污染。目前，縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、貽貝、文蛤(Meretrximeretrxi)、牡蠣等海洋雙殼類對(duì)重金屬污染的抗氧化酶活性已有較多的研究報(bào)道[15-20]，但有關(guān)銅污染對(duì)企鵝珍珠貝的抗氧化系統(tǒng)的影響卻罕見報(bào)道。筆者將企鵝珍珠貝暴露于一定銅含量條件下，探索肝胰腺組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性的變化規(guī)律，進(jìn)一步了解企鵝珍珠貝在重金屬影響下的生理機(jī)制，為拓展海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)手段提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用分析純五水硫酸銅購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用海水取自海南省陵水縣新村港海域，經(jīng)48 h暗沉淀、砂濾以及紫外消毒處理，鹽度為33.1。試驗(yàn)用1齡企鵝珍珠貝，殼長(zhǎng)(86.72±8.59) mm，殼高(82.01±5.46) mm，殼寬(30.25±2.47) mm，體質(zhì)量(88.24±13.32) g，采自陵水縣黎安港，在0.7 m3水泥池中暫養(yǎng)15 d。期間投喂球等邊金藻(Isochrysisgalbana)，平均水溫為(27.6±1.0) ℃。試驗(yàn)前1 d停止投餌，選擇反應(yīng)靈敏、閉合力強(qiáng)、體質(zhì)量及規(guī)格相近的企鵝珍珠貝作為試驗(yàn)對(duì)象。用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的抗氧化酶活性。

1.2 方法

試驗(yàn)在容積為0.2 m3玻璃鋼水桶中進(jìn)行。試驗(yàn)期間，每日更換Cu2+溶液1次，24 h持續(xù)充氣，貝密度為0.1個(gè)/L。根據(jù)已有的研究結(jié)果[15,21]，設(shè)計(jì)3個(gè)Cu2+質(zhì)量濃度組和對(duì)照組，質(zhì)量濃度分別為10、20、40 μg/L，每個(gè)處理3個(gè)平行。暴露時(shí)間為96 h，試驗(yàn)期間不投餌，分別于0、6、12、24、48、72、96 h隨機(jī)取樣，測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性(U/mg)。取試驗(yàn)貝肝胰腺0.5 g，剔除結(jié)締組織，用消毒生理鹽水沖洗，置于離心管內(nèi)液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定抗氧化酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)活性系數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，得到組間的差異顯著性；利用作圖軟件SigmaPlot 12.0作圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同銅質(zhì)量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性

對(duì)照組企鵝珍珠貝的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性變化很小(P>0.05)，說(shuō)明在未添加Cu2+的海水中，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力相對(duì)穩(wěn)定，其他3組企鵝珍珠貝肝胰臟中抗氧化酶的活性則隨時(shí)間的推延而增長(zhǎng)。Cu2+質(zhì)量濃度為10 μg/L時(shí)，96 h內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性持續(xù)上升，72 h活性最高，兩者間差異不顯著(P>0.05)；12～24 h谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著提高(P<0.05)，而24 h之后酶活力變化平穩(wěn)。20 μg/L時(shí)，0～6 h谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力激增(P<0.05)，72～96 h則明顯下降(P<0.05)，12 h活性最高，12～72 h則保持較高的活力水平。隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，40 μg/L試驗(yàn)組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性平穩(wěn)升高，72 h達(dá)到峰值，隨后則平穩(wěn)下降，該組的峰值不及前2組的峰值高(圖1)。

2.2 不同銅質(zhì)量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中過(guò)氧化氫酶的活性

96 h內(nèi)對(duì)照組企鵝珍珠貝肝胰臟中過(guò)氧化氫酶的活性較穩(wěn)定。10 μg/L Cu2+質(zhì)量濃度組肝胰臟中過(guò)氧化氫酶活性在24 h內(nèi)增幅不大(P>0.05)，48 h則活力明顯升高，隨后又明顯下降(P<0.05)。20 μg/L Cu2+質(zhì)量濃度組的過(guò)氧化氫酶活性則隨時(shí)間推移持續(xù)上升，72 h達(dá)最大值，96 h則保持相對(duì)平穩(wěn)的水平(P>0.05)。暴露于40 μg/L Cu2+質(zhì)量濃度組的過(guò)氧化氫酶活力則出現(xiàn)“上升—下降”的變化規(guī)律，暴露6 h 酶活性顯著升高(P<0.01)，直至48 h仍然保持較高活力，72 h明顯下降(P<0.05)。10 μg/L Cu2+質(zhì)量濃度組過(guò)氧化氫酶活性的峰值均顯著低于20 μg/L 和40 μg/L Cu2+質(zhì)量濃度組的最高值(圖2)。

圖1 不同Cu2+質(zhì)量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性

圖2 不同Cu2+質(zhì)量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中過(guò)氧化氫酶的活性

2.2 不同銅質(zhì)量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性

試驗(yàn)期間對(duì)照組企鵝珍珠貝肝胰臟中的超氧化物歧化酶活性一直較低，而10 μg/L Cu2+質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升趨勢(shì)，72 h達(dá)到最大值，96 h活性顯著下降(P<0.01)。Cu2+質(zhì)量濃度為20 μg/L時(shí)，超氧化物歧化酶活性呈“上升—下降”的變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在24 h，隨后平穩(wěn)下降。Cu2+質(zhì)量濃度為40 μg/L組企鵝珍珠貝肝胰臟中的超氧化物歧化酶活性在96 h內(nèi)平穩(wěn)增長(zhǎng)，96 h酶活性最大，而24 h便進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的較高酶活性水平(圖3)。

圖3 不同Cu2+質(zhì)量濃度下企鵝珍珠貝肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性

3 討 論

3.1 重金屬銅對(duì)企鵝珍珠貝肝胰臟抗氧化酶活性的影響

環(huán)境中的重金屬進(jìn)入無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧產(chǎn)物，包括過(guò)氧化氫、游離態(tài)氧等。這些活性氧產(chǎn)物的積累使機(jī)體中多不飽和脂肪酸被過(guò)氧化或造成DNA氧化損傷等，體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)便會(huì)激活，清除活性氧、抵御氧化損傷[22-23]。超氧化物歧化酶可將OH和O2-轉(zhuǎn)化為O2和H2O2；過(guò)氧化氫酶將有害物質(zhì)H2O2分解成O2和H2O；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶則作為底物可分解多種過(guò)氧化物[24-26]。這些抗氧化酶構(gòu)成了主要保護(hù)酶系統(tǒng)，防御機(jī)體氧化損傷。企鵝珍珠貝暴露在20 μg/L質(zhì)量濃度Cu2+時(shí)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性在短時(shí)間內(nèi)快速上升，而40 μg/L質(zhì)量濃度組則上升緩慢，說(shuō)明高質(zhì)量濃度銅對(duì)肝胰腺中細(xì)胞起到一定的損傷，限制了谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的提升。在40 μg/L質(zhì)量濃度下，過(guò)氧化氫酶活性在短時(shí)間內(nèi)便快速上升，顯著高于其他劑量組，說(shuō)明高質(zhì)量濃度Cu2+溶液對(duì)過(guò)氧化氫酶活性的誘導(dǎo)較靈敏。在Cu2+污染時(shí)12 h內(nèi)超氧化物歧化酶活性被逐漸誘導(dǎo)，隨著活性氧產(chǎn)物的誘導(dǎo)增加，在12 h后達(dá)到較高活性，而40 μg/L質(zhì)量濃度組中，直至96 h，肝胰腺中超氧化物歧化酶活性仍然保持較高的活性，說(shuō)明較高質(zhì)量濃度Cu2+可持續(xù)誘導(dǎo)超氧化物歧化酶的活性。其他貝類如菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)在銅污染下抗氧化酶先誘導(dǎo)后抑制，大量活性氧產(chǎn)物未能及時(shí)清除，機(jī)體受到損失并使酶活力受到抑制[27]。而本研究中，重金屬銅對(duì)企鵝珍珠貝肝胰臟中的抗氧化酶均無(wú)明顯的抑制作用，說(shuō)明抗氧化酶對(duì)活性氧產(chǎn)物的清除能力較強(qiáng)，企鵝珍珠貝肝胰臟組織對(duì)銅污染具有一定的耐受能力。

3.2 抗氧化酶對(duì)重金屬銅的靈敏度

銅是多種清池消毒劑、殺蟲農(nóng)藥等的主要成分，農(nóng)業(yè)環(huán)境中殘留量較大，對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染日益嚴(yán)重。挖掘生物體內(nèi)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)可有效發(fā)現(xiàn)生存環(huán)境的污染程度，抗氧化酶則是一類靈敏度較高的分子生態(tài)毒理學(xué)指示物。有研究表明，不同含量Cu2+污染時(shí)，長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)閉殼肌、鰓和消化腺中的抗氧化酶系統(tǒng)隨時(shí)間推移呈“上升—峰值—下降”的變化規(guī)律，而消化腺的敏感性則為最高，因此，長(zhǎng)牡蠣消化腺中的抗氧化酶對(duì)環(huán)境中Cu2+有一定指示作用[28]。企鵝珍珠貝肝胰腺中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性在Cu2+作用下出現(xiàn)一定的變化規(guī)律，不同質(zhì)量濃度Cu2+污染對(duì)機(jī)體氧化損傷程度不同，因而抗氧化酶的靈敏度各不相同。受到污染時(shí)抗氧化酶活性可誘導(dǎo)或抑制，可作為生態(tài)污染監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物[29-33]。本研究中，企鵝珍珠貝的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性與污染物有顯著的“時(shí)間—含量—活性”相關(guān)效應(yīng)，可作為重金屬Cu2+污染的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物，肝胰腺中抗氧化酶靈敏度依次為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶>過(guò)氧化氫酶>超氧化物歧化酶。