楊世平，周嘉豪，孫成波，曹佩星，王成桂，陳兆明，羅 鵬

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510301 )

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展，不少養(yǎng)殖品種均面臨著品種老化和退化、養(yǎng)殖動物病害的頻繁發(fā)生、養(yǎng)殖水體環(huán)境的日益惡化三大問題，已成為阻礙我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸[1]。蝦池內(nèi)的總氮量約有90%為人工投餌造成，其中只有19%轉(zhuǎn)化為蝦體內(nèi)的氮，有62%～68%的氮沉積于淤泥中，有8%～12%是以溶解氮等形式存在于池水中。這些污染物或沉積到蝦池底部，或直接排入養(yǎng)殖環(huán)境中，導(dǎo)致環(huán)境的污染越來越嚴(yán)重，養(yǎng)殖過程中的病害也越來越難控制[2]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，往往使用消毒劑或抗生素來進(jìn)行疾病的預(yù)防和控制，造成了生物抗藥性的增加和藥物殘留等問題[3]。而微生物制劑的綠色環(huán)保、無殘留、不產(chǎn)生抗性和作用廣泛等優(yōu)點，已成為當(dāng)代水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素等化學(xué)藥劑最有潛力的替代品[3-5]。同時，微生物制劑還具有降低水體中氨氮、亞硝酸鹽等有毒物質(zhì)，調(diào)控對蝦養(yǎng)殖水體水質(zhì)，穩(wěn)定藻相的作用，為對蝦的養(yǎng)殖成功提供一個良好的水環(huán)境[6]。

芽孢桿菌(Bacillus)是人類發(fā)現(xiàn)最早的細(xì)菌之一，它在工業(yè)酶、生物防治和微生物添加劑等領(lǐng)域已有很多的研究和應(yīng)用。芽孢桿菌作為一種微生物制劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已有諸多報道。具有清除各種有機(jī)污染和氨氮等有毒物質(zhì)的作用，也可產(chǎn)生抗菌素等抑制有害細(xì)菌的生長，改善水產(chǎn)動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，提高免疫力、消化酶活力和成活率等[6-15]。乳酸菌具有產(chǎn)生乳酸、調(diào)節(jié)微生物菌群、維持微生態(tài)平衡等作用[16]。而產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌具有乳酸菌和芽孢桿菌的特點，已被用于斷奶仔豬中，能提高斷奶仔豬的日增質(zhì)量和血清中的白蛋白和總蛋白含量，增強(qiáng)仔豬的免疫力[17]。目前，關(guān)于產(chǎn)乳酸芽孢桿菌在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用尚未見報道。因此，筆者使用不同密度的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌直接投入對蝦養(yǎng)殖后期水體中，研究其對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，以期為產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌由廣東八方生物科技有限公司提供，含量為2.0×1010cfu/g；凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)取自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物基地，選取(9.0±0.8) cm同一批次健康、活力好的凡納濱對蝦，暫養(yǎng)3 d 后進(jìn)行試驗。

1.2 試驗設(shè)計

模仿室外池塘養(yǎng)殖，試驗在0.3 m3的玻璃鋼桶中進(jìn)行，裝入養(yǎng)殖后期海水200 L，每個試驗桶放入10尾凡納濱對蝦。試驗分為對照組和3個試驗組，各組分別投放芽孢桿菌0、0.1、1、10 g，使投放的芽孢桿菌的密度為0、104、105cfu/mL和106cfu/mL，每組設(shè)3個平行。所有的試驗桶均實行同樣的管理措施。每日測量一次水質(zhì)和總異養(yǎng)菌、弧菌(Vibrio)以及芽孢桿菌的變化，持續(xù)7 d，期間不進(jìn)行換水處理。試驗水體鹽度28，溫度(28±1) ℃，pH 8.0±0.2。

1.3 水樣的采集及指標(biāo)測定

采樣時間為每日8:30，采樣后直接帶回實驗室進(jìn)行測定。氨氮采用改良的次溴酸鈉氧化法分光光度法測定[18]，亞硝酸鹽氮采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定，硝酸鹽氮采用鋅鎘還原法測定，活性磷(可溶性活性磷)采用磷鉬藍(lán)法測定[19]?？偖愷B(yǎng)菌、弧菌及芽孢桿菌分別采用2216E 培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用稀釋涂布平板法測定[20]。芽孢桿菌測定時，水樣需要80 ℃的水浴20 min。30 ℃恒溫培養(yǎng)24～72 h后，計數(shù)菌落數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，并在0.05水平上對結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水體中理化因子的影響

2.1.1 氨氮

圖1 養(yǎng)殖水體中氨氮的變化同一時間的柱形圖中不同小寫字母表示差異顯著，下同.

試驗期間水體中的氨氮含量情況見圖1。投放芽孢桿菌后，104、105cfu/mL密度組水體中氨氮含量先出現(xiàn)增加趨勢，到第3 d時，氨氮含量顯著高于對照組(P<0.05)。各試驗組第6 d和第7 d時，均出現(xiàn)小幅增加，但投放芽孢桿菌的各試驗組水體中氨氮含量顯著低于對照組(P<0.05)。

2.1.2 亞硝酸鹽氮

試驗期間水體中的亞硝酸鹽氮含量變化見圖2。同氨氮含量變化一樣，在第4 d時，各試驗組的亞硝酸鹽氮含量均有小幅下降，隨后開始上升。至6 d時，各投放芽孢桿菌的試驗組水體中亞硝酸鹽氮含量達(dá)最高，隨后開始下降。第7 d時，投放芽孢桿菌的各試驗組水體中亞硝酸鹽氮含量顯著低于對照組(P<0.05)。

圖2 養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的變化

2.1.3 硝酸鹽氮

試驗期間水體中的硝酸鹽氮含量變化見圖3。投放芽孢桿菌的各試驗組水體中硝酸鹽氮含量變化規(guī)律與氨氮、亞硝酸鹽氮相似。在第4 d時，各試驗組的硝酸鹽氮含量均有小幅下降，但隨后又開始增加。除第1 d以外，投放芽孢桿菌的各試驗組水體中硝酸鹽氮含量與對照組間均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 養(yǎng)殖水體中硝酸鹽氮的變化

2.2 芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水體中微生物的影響

2.2.1 總異養(yǎng)菌

水體中總異養(yǎng)菌的變化見圖4。各投放芽孢桿菌的試驗組總異養(yǎng)菌的密度從試驗一開始均高于對照組，到第4 d時，各投放芽孢桿菌的試驗組總異養(yǎng)菌密度達(dá)到最高，且均顯著高于對照組(P<0.05)。到第5 d后各投放芽孢桿菌的試驗組的總異養(yǎng)菌密度開始減少。到第7 d時，只有106cfu/mL密度組的總密度高于對照組。

2.2.2 弧菌

水體中弧菌的變化見圖5。在投放芽孢桿菌第2 d和第3 d，各投放芽孢桿菌的試驗組弧菌密度與總異養(yǎng)菌密度一樣，達(dá)到最高且均顯著高于對照組(P<0.05)。試驗期間僅有第7 d，對照組弧菌密度顯著高于各投放芽孢桿菌的試驗組(P<0.05)。

圖5 水體中弧菌的變化

2.2.3 芽孢桿菌

投放芽孢桿菌的各試驗組水體中芽孢桿菌的變化見圖6。投放芽孢桿菌后，各試驗組芽孢桿菌的密度呈現(xiàn)一個上升的趨勢，到第4 d時，各投放芽孢桿菌的試驗組芽孢桿菌的密度達(dá)到最高，第4 d后開始下降。第6 d時，各試驗組芽孢桿菌的密度差異縮小，105cfu/mL和106cfu/mL間的芽孢桿菌的密度無顯著差異(P>0.05)。各投放芽孢桿菌組的芽孢桿菌密度在整個試驗期間均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖6 水體中芽孢桿菌的變化

3 討 論

3.1 芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水體理化因子的影響

芽孢桿菌是普遍存在的一類好氣性細(xì)菌[18]，它也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見的微生物制劑，可以分解養(yǎng)殖過程中殘留的各種廢物，有效降低養(yǎng)殖水體中的化學(xué)需氧量和生物需氧量，以及氨氮和亞硝酸鹽氮等有害物質(zhì)的含量，同時為單細(xì)胞藻類為主的浮游植物提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)水質(zhì)各種營養(yǎng)物質(zhì)的良性生態(tài)循環(huán)[1,6,21-23]。在本試驗中，投放芽孢桿菌的各試驗組在試驗結(jié)束時，養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮的含量均顯著低于對照組(P<0.05)，說明芽孢桿菌能有效去除養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮。與使用枯草芽孢桿菌制劑來改善羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[24]、鱖魚(Sinipercachuatsi)[25]等養(yǎng)殖水體水質(zhì)的試驗結(jié)果相似。試驗中還發(fā)現(xiàn)，在投入芽孢桿菌后的第3 d，104cfu/mL和105cfu/mL試驗組的氨氮含量顯著高于對照組(P<0.05)，原因可能為本試驗?zāi)M了室外池塘養(yǎng)殖條件，用養(yǎng)殖后期的池塘水作為試驗用水，養(yǎng)殖水體中各種有機(jī)廢物的本底含量較高，投入芽孢桿菌后，加速了各種有機(jī)廢物的分解，從而導(dǎo)致氨氮含量的短暫升高。杭小英等[24]研究枯草芽孢桿菌制劑對羅氏沼蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的影響，出現(xiàn)了類似的結(jié)果。這也提示在使用芽孢桿菌等微生物制劑時，需要長期有規(guī)律的使用，如果在養(yǎng)殖水體中有機(jī)物積累較多才使用，會有導(dǎo)致氨氮含量短暫升高的風(fēng)險。

3.2 芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水體中微生物的影響

養(yǎng)殖水體中微生物的主要種類包括一些對水環(huán)境有益的微生物，如芽孢桿菌、亞硝化菌、乳酸桿菌，也包括一些有害的微生物，如副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等[26]，它們組成了一個動態(tài)平衡系統(tǒng)，這種平衡一旦被打破，有害細(xì)菌的大量繁殖，就會導(dǎo)致養(yǎng)殖對象產(chǎn)生疾病。本試驗采用對蝦養(yǎng)殖后期池塘水進(jìn)行試驗，水體的總異養(yǎng)菌、弧菌和芽孢桿菌的密度較高，分別達(dá)107～108cfu/mL、104～105cfu/mL和102～104cfu/mL。總異養(yǎng)菌、弧菌的密度與測定的凡納濱對蝦苗種淡化期間養(yǎng)殖水體密度相近[27]，高于李卓佳等[20]測定的高位池養(yǎng)殖水體中的密度。試驗中，投入芽孢桿菌后，水體的總異養(yǎng)菌和芽孢桿菌的密度均顯著增加(P<0.05)。在試驗結(jié)束時，水體中弧菌的密度也顯著低于對照組(P<0.05)，說明投放的芽孢桿菌能在養(yǎng)殖水體中存活和繁殖，結(jié)合水質(zhì)數(shù)據(jù)指標(biāo)，起到了改善水質(zhì)的作用。但在投入芽孢桿菌后的第2 d和第3 d，水體中弧菌密度卻顯著高于對照組，與王春迪等[14,28]的研究結(jié)果不同。硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基能夠培養(yǎng)養(yǎng)殖水體中的弧菌，但部分非弧菌的細(xì)菌也能在其上良好生長[29]。因此，養(yǎng)殖水體的弧菌密度的增加可以有兩個原因。一是檢測方法的不準(zhǔn)確，總異養(yǎng)菌的增加，一些非弧菌細(xì)菌因有硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基而生長。二是因為本試驗采用的是養(yǎng)殖后期池塘水作為試驗用水，芽孢桿菌的添加，加速水體中有機(jī)營養(yǎng)物的釋放，從而導(dǎo)致弧菌密度的短期升高，具體原因有待進(jìn)一步研究。