劉 冰 霍會永 馮社軍 曹 凌 趙 現(xiàn) 曹 妍 薛 靖 王如科 李軍濤

目前，腦膠質(zhì)瘤的治療仍是醫(yī)學(xué)上的一個難題，現(xiàn)階段主要以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放療和化療，但總體治療效果不理想，主要是由于惡性膠質(zhì)瘤的侵襲性行為導(dǎo)致腫瘤無法全切以及腦膠質(zhì)瘤固有的對化療及放療的抗性造成[1]。萘酰亞胺類化合物是一種DNA嵌入劑，具有良好的抗腫瘤活性[2]。UNBS5162是一種特殊的萘二甲酰亞胺，能減少前列腺癌中趨化因子配體[chemokine (C-X-C motif) ligand，CXCL]表達(dá)[3]，對體內(nèi)、外多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用[4]。本研究通過體外實驗，觀察UNBS5162對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移和侵襲的抑制作用，通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白[B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)]及磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路相關(guān)蛋白[AKT、哺乳動物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)、70S核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase beta-1，p70S6K)]的表達(dá)情況，探討UNBS5162對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用及機(jī)制，為研究高效、低毒的抗腫瘤藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251(上海中科院細(xì)胞庫)，HY-16509 UNBS5162 (美國MCE公司)，RPMI-1640培養(yǎng)液(美國HYCLONE公司)，血清(美國Gibco公司)，雙抗(美國SIGMA公司)，0.25%胰酶消化液[加乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)]購于北京索萊寶公司，RIPA(radio immunoprecipitation assay)蛋白裂解液、BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，Transwell小室(美國Millipore公司)，CCK8-kit(北京索萊寶公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京四正柏公司)，一抗(兔抗人)AKT、p-AKT、mTOR 、p-mTOR(美國CST)，p70S6K、Bcl-2、Bax、活化的Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(美國PTG)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，用PBS清洗3次，經(jīng)胰酶消化，細(xì)胞變圓后，加入培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打為單細(xì)胞懸液，種植到6孔板中進(jìn)行后續(xù)實驗。UNBS5162處理的細(xì)胞作為實驗組(UNBS5162)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的細(xì)胞作為對照組。

1.2.2 CCK8增殖檢測 將對數(shù)生長期U251細(xì)胞消化計數(shù)，取懸液100 μL，以每孔1 000個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)種到96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。對照組加1‰ DMSO，實驗組加入UNBS5162，于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔24 h檢測1次細(xì)胞活力，檢測前，每孔加10 μL CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，450 nm酶標(biāo)儀檢測吸光度A值，以A450值間接反映細(xì)胞存活數(shù)量和增殖能力。

1.2.3 Transwell侵襲和遷移實驗 侵襲實驗：采用Transwell小室法構(gòu)建侵襲模型，將提前過夜融化的Matrigel基質(zhì)膠100 μL(無血清培養(yǎng)液按1∶6稀釋)加入到24孔板的Transwell上室中，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置4～6 h成膠，吸干培養(yǎng)液，下室中加500 μL無血清培養(yǎng)液，靜置30 min,水化基底膜。用無血清RPMI-1640制備細(xì)胞懸液，將100 μL細(xì)胞懸液(1×105個)加入上室中，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)液。過夜，取出小室，棉簽擦掉上室中殘余的細(xì)胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗后，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，拍照觀察計數(shù)。

遷移實驗：步驟類似侵襲實驗，Transwell小室無需 Matrigel基質(zhì)膠處理，加入Transwell上室中的細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為5 000個。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 采用10 μmol/L UNBS5162處理細(xì)胞24 h為實驗組，對照組細(xì)胞為DMSO處理，更換成無血清培養(yǎng)基，常規(guī)條件下，饑餓培養(yǎng)24 h。收集實驗組以及對照組細(xì)胞進(jìn)行離心(1 000 r/min，5 min)，4℃預(yù)冷的PBS洗2次，加入緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為(1～5)×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL 細(xì)胞凋亡檢測試劑Annexin V-FITC于室溫避光孵育5 min。加10 μL碘化丙啶(propidium Iodide，PI)染液與400 μL PBS，進(jìn)行檢測。采用FlowJo軟件對流式結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測(Western blot) U251細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L UNBS5162處理24 h后，RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定其濃度。每個樣本取20 μg蛋白通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人Bcl-2、Bax、活化的Caspase-3、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K(一抗?jié)舛?∶1 000)4℃孵育過夜，采用TBST(tris buffered saline tween)緩沖液清洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，洗膜后，加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影。QUANTITY ONE 軟件掃描灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值形式計算各蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 UNBS5162對U251細(xì)胞增殖的影響 10 μmol/L UNBS5162處理細(xì)胞24 h后，CCK8實驗結(jié)果表明，實驗組吸光度值低于對照組(P<0.05)；繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h后，U251細(xì)胞增殖能力依然低于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 UNBS5162對U251細(xì)胞增殖的影響(吸光度A值，

2.2 UNBS5162對U251細(xì)胞侵襲和遷移的影響 10 μmol/L UNBS5162處理細(xì)胞24 h后，Transwell實驗顯示，與對照組相比，實驗組細(xì)胞侵襲數(shù)減少[(18±5)個 比 (32±2)個，t=4.503，P=0.011]，實驗組細(xì)胞遷移數(shù)也同樣降低[(30±2)個 比 (78±4)個，t=18.590，P<0.001]。詳見圖1。

圖1 UNBS5162對 U251細(xì)胞遷移和侵襲的影響

注：A為對照組侵襲細(xì)胞；B為實驗組侵襲細(xì)胞；C 為對照組遷移細(xì)胞；D為實驗組遷移細(xì)胞

2.3 UNBS5162對U251細(xì)胞的凋亡的影響 與對照組相比，10 μmol/L UNBS5162處理細(xì)胞24 h后，實驗組U251細(xì)胞凋亡率增加[(24.46±2.03)% 比 (5.75±0.74)%，t=14.998，P<0.001)。Western blot實驗顯示，與對照組相比，UNBS5162處理后U251細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)量下降[(0.36±0.032) 比 (1.00±0.043)，t=20.681，P<0.001]，而Bax和活化的Caspase-3表達(dá)量均上升[(1.69±0.141) 比 (1.00±0.067)，t=7.689，P=0.002；(1.35±0.066) 比 (1.00±0.055)，t=7.056，P=0.002]。詳見圖2。

圖2 UNBS5162對U251細(xì)胞凋亡的影響

注：A為流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡；B為Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白

2.4 UNBS5162對U251細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot實驗顯示，與對照組相比，實驗組細(xì)胞中AKT和mTOR的磷酸化水平(p-AKT、p-mTOR)受到抑制[(0.654±0.097) 比 (1.000±0.084)，t=4.670，P=0.009；(0.599±0.070) 比 (1.000±0.098)，t=5.767，P=0.004]，其下游細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p70S6K表達(dá)水平也相應(yīng)降低[(0.703±0.094) 比 (1.000±0.108)，t=3.593，P=0.023]。詳見圖3。

圖3 UNBS5162處理對PI3K/AKT 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

3 討論

作為抗腫瘤藥物，萘酰亞胺類化合物作用顯著，不僅能嵌入DNA，抑制DNA和RNA的合成，同時也能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，己成為近幾年研究的熱點之一[5-7]。UNBS5162是一種特殊的萘酰亞胺衍生物，目前研究多集中于其在腫瘤新血管生成和細(xì)胞自體吞噬中的作用[8-10]，而對于UNBS5162在腫瘤細(xì)胞抑制作用方面研究較少。本研究中，采用10 μmol/L UNBS5162處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251后，通過CCK8實驗檢測發(fā)現(xiàn)，UNBS5162能夠顯著降低U251細(xì)胞增殖能力，其表現(xiàn)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力與前人在其他腫瘤中的實驗結(jié)果相似[11]。另外，本研究通過Transwell實驗檢測還發(fā)現(xiàn)，UNBS5162處理后U251細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著低于對照組，表明UNBS5162還能夠抑制U251細(xì)胞遷移和侵襲能力。以上結(jié)果提示UNBS5162對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。近些年，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的迅速發(fā)展，以及對細(xì)胞凋亡現(xiàn)象、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的廣泛深入的研究，人們已經(jīng)對細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)通路有了一定程度的了解。本研究發(fā)現(xiàn)，UNBS5162能促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致U251細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降，促凋亡蛋白Bax、活化的Caspase-3表達(dá)量上升，提示UNBS5162可通過誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的變化促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)合前人研究[11]，本研究認(rèn)為UNBS5162可作為一個潛在的抗腫瘤試劑用于抑制膠質(zhì)瘤生長和轉(zhuǎn)移。

膠質(zhì)瘤的發(fā)生涉及多種原癌基因和抑癌基因的結(jié)構(gòu)與功能異常，是一種多基因異常疾病。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膠質(zhì)瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成及對放化療藥物的耐藥等細(xì)胞活動中起重要作用[12-15]。AKT可調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)事件，如生存和凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、侵襲和遷移、細(xì)胞周期調(diào)控、血管生成和端粒的維持。mTOR是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能磷酸化AKT的第473位絲氨酸并使之活化，進(jìn)而激活A(yù)KT的活性。AKT也可通過磷酸化mTOR的Ser-448 位點而激活mTOR，mTOR可磷酸化下游分子核糖體蛋白p70S6K，進(jìn)而激活其促進(jìn)細(xì)胞增殖等相關(guān)功能，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，與腫瘤發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[16-18]。本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，UNBS5162能抑制U251細(xì)胞中AKT和mTOR的磷酸化水平，且下游細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p70S6K表達(dá)水平也相應(yīng)降低。以上結(jié)果有力地證明了UNBS5162對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用與PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，UNBS5162對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用，能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡，其分子機(jī)制可能與UNBS5162抑制PI3K信號通路的激活有關(guān)。