朱慧敏，李 莉

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830000)

新疆黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)是小檗科(Berberisheteropoda)小檗屬(Berberisheteropoda.L.)灌木植物[1-2]，又名刺黃連、刺黃柏和則熱克(維吾爾藥名)。小檗根氣微，味苦，小檗根皮性涼，有清熱瀉火的作用[3-4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黑果小檗主要含有生物堿[5-6]、黃酮[7]、色素[8]、花色苷[9-10]和脂肪酸等[11]物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑果小檗具有抗菌[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化[14]、誘變[15]和抗肝損傷[16]等廣泛的藥理作用。資源分布廣泛，開(kāi)發(fā)潛力很大[17]。在民間，本屬植物根皮常代替黃柏、黃連藥用。維吾爾醫(yī)、哈薩克醫(yī)常用其治療胃腸炎、痢疾、痔瘡、急性結(jié)膜炎和泌尿系統(tǒng)感染等，具有抗菌消炎的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，新疆黑果小檗中的小檗堿和小檗胺對(duì)金黃色葡萄球菌等腸道致病菌具有抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合牛津杯法與倍比稀釋法[20-21]對(duì)新疆黑果小檗對(duì)腸道致病菌的抑菌作用進(jìn)行研究，為藥用植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 ES-315高壓滅菌鍋(日本TOM Y Seiko有限公司)；HH-S4恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)(上海一恒科技有限公司)；TS-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；TB-114電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；內(nèi)徑Φ6.0 mm×10.0 mm牛津杯(上海儀翀科技發(fā)展有限公司)。

1.2試藥 新疆黑果小檗根于2015年9月采自烏魯木齊市東白楊溝，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布利孜教授鑒定為小檗科小檗屬植物黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)的根。室溫陰干，粉碎，備用。阿莫西林膠囊(中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)06107627)；金黃色葡萄球菌(批號(hào)CMCC 16412)、大腸桿菌(批號(hào)CMCC 44102)、銅綠假單胞菌(批號(hào)MCCCB 10104)和糞腸球菌(批號(hào)ATCC 2912)，均由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3材料 M-H瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20160217)，M-H肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)20161107)，青海高科園海博生物技術(shù)有限公司；注射用生理鹽水(國(guó)藥集團(tuán)新疆制藥有限公司，批號(hào)150303)；水為自制蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1樣品溶液的制備 分別稱(chēng)取50 g黑果小檗根皮、根木質(zhì)部，置于1 000 mL圓底燒瓶中，分別加入10倍量甲醇溶液，70 ℃回流提取2次，每次提取2 h，取出，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，合并濾液，60 ℃減壓回收甲醇，得甲醇提取物浸膏。將所得甲醇提取物浸膏置于100 mL量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度。分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮依次萃取，得不同溶劑萃取液，揮干溶劑，得不同溶劑萃取物浸膏，稱(chēng)定質(zhì)量。精密稱(chēng)取一定量不同溶劑萃取物浸膏，分別置于5 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得一定質(zhì)量濃度的樣品溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃冰箱中冷藏，備用。見(jiàn)表1。

表1各樣品稱(chēng)樣量及質(zhì)量濃度

Tab.1 Samples weight and concentration

提取部位有效部位名稱(chēng)稱(chēng)樣量/mg質(zhì)量濃度/mg·mL-1回流法提取根皮石油醚部位(A)112.25022.450二氯甲烷部位(B)144.87528.975乙酸乙酯部位(C)320.25064.050正丁醇部位(D)350.00070.000丙酮部位(E)262.00052.400 回流法提取根木質(zhì)部石油醚部位(K)339.62567.925二氯甲烷部位(L)137.87527.575乙酸乙酯部位(M)55.75011.150正丁醇部位(N)142.37528.475丙酮部位(O)303.75060.750

2.1.2抗菌藥物儲(chǔ)存液的制備 精密稱(chēng)取阿莫西林10.8 mg，置于5 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為2.16 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，將配制好的抗菌藥物貯存液貯存于4 ℃冰箱中，備用。

2.1.3培養(yǎng)基的制備 使用NCCLS推薦使用Mueller-hinton(M-H)瓊脂培養(yǎng)基以及Mueller-hinton(M-H)肉湯培養(yǎng)基，pH值為7.2～7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。

2.1.3.1M-H瓊脂培養(yǎng)基的配制 將41.2 g M-H瓊脂培養(yǎng)基，緩慢攪拌加入盛有1 000 mL熱水的具塞錐形瓶中，待培養(yǎng)基全部融化，封住瓶口，置于121 ℃滅菌鍋中濕熱滅菌30 min。

2.1.3.2M-H肉湯培養(yǎng)基的配制 將21.0 g M-H肉湯培養(yǎng)基，緩慢攪拌加入盛有1 000 mL熱水的具塞錐形瓶中，待培養(yǎng)基全部融化，封住瓶口，置于121 ℃滅菌鍋中濕熱滅菌30 min。

2.1.4細(xì)菌生長(zhǎng)法制備菌懸液 分別將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌的凍存菌室溫融化后，在超凈工作臺(tái)中，用經(jīng)高壓濕熱滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方法將細(xì)菌涂布于M-H平面培養(yǎng)基上，置于35～37 ℃、5%～10% CO2的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)分別挑取上述4種菌的單個(gè)菌落，接種于M-H液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24 h，用注射用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度(1×108cfu·mL-1)，備用。

2.1.5抑菌活性研究

2.1.5.1平板制備 將直徑90 mm、高16～17 mm的平底雙碟置于超凈工作臺(tái)上，用經(jīng)高壓濕熱滅菌的棉簽蘸取一定量2.1.4項(xiàng)下制備的0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)菌懸液均勻涂抹于碟底，注入融化狀態(tài)的2.1.3.1項(xiàng)下制備的M-H瓊脂培養(yǎng)基4 mm，使其在碟底均勻攤布，待其凝固，作為底層。另取2.1.3.1項(xiàng)下的M-H瓊脂培養(yǎng)基10 mL，放冷至48～50 ℃，加入2.1.4項(xiàng)下制備的菌懸液100 μL，搖勻，在底層均勻攤布，作為菌層。

2.1.5.2牛津杯法測(cè)定抑菌活性 待2.1.5.1項(xiàng)下制備的的平板冷卻后，在各平板中以等距離均勻放置已滅菌的牛津杯3個(gè)，分別加入100 μL的供試品溶液和抗菌藥物貯存液，同時(shí)以相同體積的蒸餾水作為空白對(duì)照，將平板置于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈大小，平行3次實(shí)驗(yàn)。

2.1.5.3常量肉湯稀釋法的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)測(cè)定 取無(wú)菌試管(13 mm×100 mm)13支，排成一排，每管加入2.1.3.2項(xiàng)下制備的M-H肉湯培養(yǎng)基1 mL以及2.1.4項(xiàng)下制備的菌懸液20 μL，在第1管中加入供試品原液1 mL，混勻，吸取1 mL加入第2管，混勻，再吸取1 mL加入第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1 mL棄去，第12管為不含供試品的生長(zhǎng)對(duì)照，第13管為加等體積蒸餾水的生長(zhǎng)對(duì)照。將接種好的稀釋管密塞，置于35～37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24 h，觀察各試管的澄清度。若試管顯示澄清，說(shuō)明試藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌有抑菌作用；若試管顯示渾濁，則說(shuō)明試藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌無(wú)抑菌作用。澄清試管的最低質(zhì)量濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度。

2.2結(jié)果

2.2.1抑菌活性 用毫米尺測(cè)量抑菌圈的大小。若試藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌有抑菌活性，則牛津杯/藥敏片周?chē)呐囵B(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的透明圈，反之則無(wú)。抑菌圈越大，說(shuō)明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小；若無(wú)抑菌圈，說(shuō)明此藥對(duì)該菌無(wú)抑菌效果。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2牛津杯法測(cè)定黑果小檗根皮、根木質(zhì)部不同萃取部位浸膏的抑菌活性結(jié)果

藥材來(lái)源萃取部位牛津杯法抑菌圈直徑/mm 大腸桿菌銅綠假單胞菌 糞腸球菌金黃色葡萄球菌根皮石油醚部位(A)- - - 10.20±0.88*##二氯甲烷部位(B) 8.25±1.03*## 7.50±0.84 8.55±0.92*23.50±0.46**##乙酸乙酯部位(C)- - - - 正丁醇部位(D)12.15±0.98*## 8.25±0.29* 9.42±0.64*26.35±0.32**##丙酮部位(E)14.11±1.21*#11.50±1.42*10.15±0.85*22.45±1.54**##根木質(zhì)部石油醚部位(K)- - - 15.50±0.35*##二氯甲烷部位(L) 6.43±0.84- 8.42±0.95*17.38±0.39*##乙酸乙酯部位(M)- - - - 正丁醇部位(N) 8.55±0.38*## 6.10±0.15- 26.46±1.42**##丙酮部位(O) 8.28±0.24*##- 6.50±1.2218.46±0.95*##阿莫西林28.50±1.28** 8.15±0.42 8.15±1.03*50.25±1.10**水-## -# -# -## P根皮-根木質(zhì)部 >0.05 <0.05 <0.05 >0.05

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與阿莫西林比較#P<0.05，##P<0.01。-表示無(wú)抑菌作用。

由表2可知，供試品對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：阿莫西林>E>D>N>B=O>L；對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：E>D>B>阿莫西林>N；對(duì)糞腸球菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：E>D>B>L>阿莫西林>O；對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的抑菌圈大小為：阿莫西林>D=N>B>E>O>L>K>A。

與空白組比較，提取物B、D和E對(duì)大腸桿菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，阿莫西林對(duì)大腸桿菌的抑制作用顯著高于空白組(P<0.01)，提取物D、E和阿莫西林對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，提取物B、D、E、L和阿莫西林對(duì)糞腸球菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，提取物A、K、L和O對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用高于空白組(P<0.05)，提取物B、D、E、N和阿莫西林對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高于空白組(P<0.05)。

通過(guò)兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)對(duì)比根皮、根木質(zhì)部的抑菌活性可知，對(duì)于4種腸道致病菌而言，根皮與根木質(zhì)部的抑菌活性相當(dāng)(P>0.05)。

綜上所述，培養(yǎng)24 h后，黑果小檗萃取物對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別在6.43～14.11，6.10～11.50，6.50～10.15和10.20～26.46 mm范圍內(nèi)。

2.2.2最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果 在2.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，研究浸膏A、B、D、E、K、L、N和O的MIC。結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，浸膏A對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為5.613 mg·mL-1；浸膏B對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為1.811，7.244，14.488和0.453 mg·mL-1；浸膏D對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為4.375，17.50，8.75和0.547 mg·mL-1；浸膏E對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為3.275，13.1，13.1和0.409 mg·mL-1；浸膏K對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為1.061 mg·mL-1；浸膏L對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為6.894，13.788和1.723 mg·mL-1；浸膏N對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.119，14.238和0.445 mg·mL-1；浸膏O對(duì)大腸桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為15.188，30.375和1.898 mg·mL-1。

表3浸膏對(duì)4種致病菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

Tab.3 The determination results of minimum inhibitory concentration (MIC) of the extracts on 4 kinds of test bacteria(mg·mL-1)

萃取部位大腸桿菌糞腸球菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌A- - - 5.613B1.8117.24414.4880.453D4.37517.5008.7500.547E3.27513.10013.1000.409K- - - 1.061L6.89413.788- 1.723N7.119- 14.2380.445O15.18830.375- 1.898

注：-表示無(wú)抑菌作用。

綜上所述，浸膏A、B、D、E、K、L、N和O對(duì)4種致病菌均有不同程度的抑制作用，培養(yǎng)24 h后，黑果小檗萃取物對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1.811～15.188，8.750～14.488，7.244～30.375和0.409～5.613 mg·mL-1。

3 討論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，新疆黑果小檗根部對(duì)4種致病菌均有不同程度的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同溶劑萃取根皮與根木質(zhì)部甲醇提取物水溶液中所得不同有效部位進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)比根皮與根木質(zhì)部對(duì)抑菌效果的影響，結(jié)果表明，根皮與根木質(zhì)部對(duì)4種致病菌的抑菌效果無(wú)差別(P>0.05)，根皮與根木質(zhì)部抑菌活性相當(dāng)。維吾爾醫(yī)常以根皮入藥，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黑果小檗根木質(zhì)部也具有一定的抑菌活性，其中根皮與根木質(zhì)部對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)銅綠假單胞菌具有抑菌作用的部位較少，由此可見(jiàn)，黑果小檗根部不同有效部位對(duì)不同腸道致病菌的抑菌效果不一，根木質(zhì)部也可作為用藥部位，且具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。

黑果小檗是我國(guó)較為重要的藥用植物資源之一，目前對(duì)黑果小檗的研究主要集中于種類(lèi)差異、成分分析等，針對(duì)黑果小檗抑菌作用的研究較少。本文采用牛津杯法和試管倍比稀釋法對(duì)新疆黑果小檗根皮及根木質(zhì)部的體外抑菌活性做了較全面的探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑果小檗根皮及根木質(zhì)部萃取液對(duì)腸道革蘭氏陰性菌以及革蘭氏陽(yáng)性菌等致病菌均有一定的抑制作用。本文驗(yàn)證了黑果小檗根皮及根木質(zhì)部確切有效的抑菌活性，對(duì)于開(kāi)發(fā)廣譜新型中藥抗菌藥物具有一定的指導(dǎo)意義，為黑果小檗用藥部位的選擇及研究黑果小檗治療由菌群紊亂引起的腸道疾病奠定基礎(chǔ)。