齊 菲，楊范莉，史亞軍，崔春利，鄒俊波，張小飛

(1.陜西中醫(yī)藥大學，西安 712046；2.西安交通大學藥學院，西安 710061)

中藥藥對是臨床上常用的配伍形式，雖然組成相對簡單，但它具有中藥配伍的基本特點[1]。藥對配伍是研究復方配伍規(guī)律的基礎和重要切入點之一，了解藥對配伍的化學成分變化，有利于闡述復方中藥配伍的機制[2-4]。當歸、川芎伍用，名曰佛手散，又名芎歸散，出自《普濟本事方》，主治妊娠傷胎、難產、胞衣不下等?！夺t(yī)宗金鑒》云：“命名不曰歸芎，而曰佛手者，謂婦人胎前、產后諸癥如佛手之神妙也。當歸、川芎為血分之主藥，性溫而味甘辛，以溫能活血，甘能補血，辛能散血也?！碑敋w川芎配對可協同增強養(yǎng)血活血、活血袪瘀及調經止痛的功效，是臨床常用的養(yǎng)血活血藥對。當歸和川芎藥材均含揮發(fā)油，文獻報道[5]，當歸和川芎的揮發(fā)油成分是這2種中藥的有效成分之一。

提取揮發(fā)油最常用的是水蒸氣蒸餾法[6]。到目前為止，實驗室多用共水蒸餾，工業(yè)上生產以隔水蒸餾為主，后者是安裝一塊多孔的隔板，將中藥置于板上，水放在板下，水面距離板有相當距離。本實驗采用Box-Behnken設計原理和方法[7-11]，確定共水蒸餾提取藥對揮發(fā)油的最佳工藝條件，利用GC-MS[12-13]分析共水蒸餾與隔水蒸餾單味藥與藥對及配伍前后的揮發(fā)油成分變化，比較2種方法提取揮發(fā)油，并為闡釋藥對當歸川芎物質基礎提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用分析儀(GC-MS，美國Agilent公司)；分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；中藥粉碎機(QE-400克，浙江屹立工貿有限公司)；揮發(fā)油提取器(鄭州市中原區(qū)興華玻璃儀器廠)；MH型電子調溫電熱套(科偉電熱儀器有限公司)。

1.2試藥 當歸、川芎飲片(陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司)；正己烷(色譜純，批號20170815)，無水硫酸鈉(分析純，批號20170320)，均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1藥對當歸川芎揮發(fā)油的提取方法 分別將當歸、川芎藥材粉碎過篩，精密稱取藥材粉末各30 g，根據《中國藥典》2015年版四部通則2204，采用共水蒸餾法進行揮發(fā)油提取，精密測定揮發(fā)油體積，計算揮發(fā)油得率。

2.2供試品溶液的制備 在揮發(fā)油中分別加入無水硫酸鈉除水，精密吸取除過水的揮發(fā)油各0.1 mL，置于10 mL量瓶中，用正己烷定容,即得。

2.3揮發(fā)油的測定條件

2.3.1色譜條件 色譜分離采用HP-5MS毛細管色譜柱，載氣為氦氣，以1 mL·min-1恒定的流速通過HP-5MS毛細管柱，進樣量：1 μL；進樣口溫度：310 ℃；柱溫程序：100 ℃，保持3 min，以3 ℃·min-1升至170 ℃，再以2 ℃·min-1升至210 ℃，再以8 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。

2.3.2質譜條件 離子源：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：280 ℃；接口溫度：280 ℃；四級桿溫度：150 ℃；檢測電壓：70 eV；質量掃描范圍(m/z):40～700 amu。

2.4揮發(fā)油的GC-MS分析 將2.2項下制備的供試品溶液按照2.3項下條件進行分析，得到總離子流圖，見圖2。采用NIST質譜數據庫檢索并進行比對，應用峰面積歸一化法計算揮發(fā)油中各化學成分的相對百分含量[14-18]。

3 實驗結果

3.1單因素實驗 以不同的提取時間、料液比和浸泡時間3個因素為指標，考察3個不同條件下揮發(fā)油得率和藥對提取的條件。

3.1.1共水蒸餾提取時間對藥對揮發(fā)油得率的影響 每次實驗取藥對粗粉60 g，在料液比1∶10和浸泡1 h的條件下，按照2.1項下方法提取，提取時間選取2，4，6，8和10 h 5個水平進行實驗。結果顯示，提取時間在8 h時揮發(fā)油得率不再明顯增高，故以8 h作為提取時間。

3.1.2料液比對藥對揮發(fā)油得率的影響 每次實驗取藥對粗粉60 g，浸泡1 h提取8 h的條件下，按照2.1項下方法提取，料液比選取1∶4,1∶6,1∶8,1∶10和1∶12進行實驗，得出料液比為1∶10時揮發(fā)油得率最高，故以1∶10作為料液比。

3.1.3浸泡時間對藥對揮發(fā)油得率的影響 每次實驗取藥對粗粉60 g，在提取8 h，料液比為1∶10的條件下，按照2.1項下方法提取，浸泡時間選取0，0.5，1，1.5和2 h 5個水平進行實驗，結果浸泡1 h時揮發(fā)油得率最高，故以1 h作為浸泡時間。

3.2響應面設計實驗

3.2.1Box-Behnken響應面法優(yōu)化共水蒸餾提取揮發(fā)油工藝 在單因素實驗的基礎上，選取影響藥對揮發(fā)油提取工藝的3個因素：提取時間(X1)、浸泡時間(X2)和料液比(X3)為考察對象，以藥對揮發(fā)油提取率(%)為評價指標，采用3因素3水平的Box-Behnken響應面法優(yōu)化藥對揮發(fā)油提取工藝，因素水平見表1，提取工藝參數實驗安排及結果見表2。

表1響應面分析實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface analysis experiment

編碼水平因素低(-1)中(0)高(1)提取時間(X1)/h6810浸泡時間(X2)/h0.511.5料液比(X3)/g·mL-11∶81∶101∶12

表2響應面分析實驗結果

Tab.2 Experimental results of the response surface analysis

序號提取時間(X1)/h浸泡時間(X2)/h料液比(X3)/g·mL-1揮發(fā)油提取率/%10-110.6421-100.6030-1-10.494-1-100.4050110.5360000.637-1100.468-1010.5591010.52100000.6211-10-10.33120000.631301-10.50140000.63151100.57160000.631710-10.66

3.2.2建立模型方程與顯著性檢驗 利用軟件Design Expert 8.0.6對實驗結果進行多元回歸擬合分析，得到揮發(fā)油得率與各因素變量的二次方程模型：Y(%)=0.628 0+0.076 250×A-0.008 75×B+0.032 5×C-0.022 5×A×B-0.09×A×C-0.03×B×C-0.072 75×A2-0.047 750×B2-0.040 250×C2，對回歸方程進行顯著性檢驗，結果見表3。

該方程的相關系數r=0.987 6，接近于1，從擬合方程的相關系數可知，多元二次項擬合方程r較高，且實驗模型P<0.000 1，結果表明，回歸方程模型擬合度好。

表3回歸模型方差分析結果

Tab.3 Variance analysis results of regression model

方差來源平方和自由度均差FP常數項0.1490.01530.72<0.000 1 A-A0.04710.04794.24<0.000 1 B-B0.000 612 510.000 612 51.240.302 1 C-C0.008 4510.008 45017.120.004 4 AB0.002 02510.002 0254.100.082 5 AC0.03210.03265.64<0.000 1 BC0.003 610.003 67.290.030 6 A^20.02210.02245.150.000 3 B^20.009 610.009 619.450.003 1 C^20.006 82110.006 82113.820.007 5殘差0.003 45570.000 493 6失擬項0.003 37530.001 12556.250.001 0純誤差0.000 0840.000 05總和0.1416

由表3可知，提取時間和料液比對藥對揮發(fā)油提取率影響較為顯著，二次項、交互項交互對揮發(fā)油提取的曲面效應極顯著。失擬項F值為0.406，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，而不顯著的失擬項是可取的，說明該回歸方程對實驗擬合情況較好，該模型能較好地描述實驗。

3.2.3響應面分析 響應面圖形是響應值對因素A、B、C所構成的三維空間曲面圖，從響應面圖上可看出各參數之間的相互作用，結果見圖1。由圖1可知，提取時間和浸泡時間之間的交互作用較為顯著。沿A軸的等高線密度變化相對沿B軸的變化較大，說明提取時間對揮發(fā)油得率的影響比浸泡時間的影響大。

3.2.4驗證實驗 根據軟件Design Expert 8.0.6分析，藥對揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為提取時間8 h，料液比為1∶8，浸泡時間為0.5 h，藥對揮發(fā)油得率的理論值可達0.689%。實際測得的揮發(fā)油得率為0.66%，RSD值為0.87%，與理論值相符，因此基于響應面法優(yōu)化的提取工藝條件準確可靠。

3.3隔水蒸餾提取藥對揮發(fā)油 用響應面優(yōu)化的最優(yōu)條件，用隔水蒸餾提取當歸川芎揮發(fā)油，平均提取率為0.63%±1.59%(n=3)。

3.4GC-MS結果分析 見圖2和表4。

圖1響應面曲線圖

Fig.1 The response surface curve

圖2總離子流圖

A.共水蒸餾當歸離子流圖；B.隔水蒸餾當歸離子流圖；C.共水蒸餾川芎離子流圖；D.隔水蒸餾川芎離子流圖；E.共水蒸餾當歸川芎離子流圖；F.隔水蒸餾當歸川芎離子流圖。

Fig.2 The graph of total ion current

A.common water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels；B.separated water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels；C.common water distillation ofLigusticumchuanxiongHort；D.separated water distillation ofLigusticumchuanxiongHort；E.common water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels andLigusticumchuanxiongHort；F.separated water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels andLigusticumchuanxiongHort.

表4化學分析結果

Tab.4 The results of chemical analysis

序號保留時間化合物分子式相對百分含量/%共水當歸共水川芎共水當歸川芎隔水當歸隔水川芎隔水當歸川芎13.6683-careneC10H160.9124.046γ-terpineneC10H160.8134.6121-methyl-4-(1-methylethylidene)-cyclohexeneC10H160.6845.338 (E,Z)-2, 2,6-dimethyl-4,6-octatrieneC10H160.6756.0215-pentylcyclohexa-1,3-dieneC11H180.8566.297endo-borneolC10H18O?0.5976.544(R)-4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-olC10H18O2.751.16?1.0389.666acetic acid,1,7,7-trimethyl-bicyclo[2.2.1]hept-2-yl esterC12H20O22.48910.5092-methoxy-4-vinylphenolC9H10O21.081.260.78?0.791013.529[3aR-(3aα,4β,7α)]-2,4,5,6,7,8-hexahydro-1,4,9,9-tetramethyl-3H-3a,7-methanoazuleneC15H24?4.691116.71[4aR-(4aα,7α,8aβ)]-decahydro-4a-methyl-1-methyl-ene-7-(1-methylethenyl)-naphthaleneC15H242.230.830.69?1.441219.992[1aR-(1aα,4aα,7β,7aβ,7bα)]-decahydro-1,1,7-trim-ethyl-4-methylene-1H-cycloprop[e]azulen-7-olC15H24O1.461.171.310.851.23?1.171322.5923-butylisobenzofuran-1(3H)-oneC12H14O22.104.353.554.13?4.081422.6932-((2S,4aR)-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octa-hydronaphthalen-2-yl)propan-2-olC15H26O1.911523.3763-butylidene-1(3H)-isobenzofuranoneC12H12O28.457.507.047.997.571623.5798-isopropyl-1,5-dimethyltricyclo[4.4.0.02,7]dec-4-en-3-oneC15H22O6.741723.6381H-2-indenone,2,4,5,6,7,7a-hexahydro-3-(1-meth-ylethyl)-7a-methylC13H20O2.041824.0595-pentylcyclohexa-1,3-dieneC11H181.761.36?1.081924.160(3aR,4R,7R)-1,4,9,9-tetramethyl-3,4,5,6,7,8-hexahydro-2H-3a,7-methanoazulen-2-oneC15H22O4.36?1.692024.944Z-butylidenephthalideC12H12O21.831.941.850.952125.148senkyunolideC12H16O21.173.0419.311.2213.282225.249p-cresyl isovalerateC12H16O216.272425.714(E)-3-butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-oneC12H14O280.857.0561.0258.8274.3357.472527.631(E)-3-butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-oneC12H14O24.181.582.822.354.07

由表4可知，當歸川芎揮發(fā)油化學成分種類較多。揮發(fā)油主要成分均為藁苯內酯，其含量最高。兩者均含有Z-正丁烯基苯酞，但當歸揮發(fā)油中的含量高于川芎揮發(fā)油，且共水大于隔水。在當歸、川芎揮發(fā)油中檢測到苯酞類、萜類和脂肪酸類等成分，其含量見圖3。由圖3可知，苯酞類含量較高。整體來看，共水蒸餾的含量大于隔水蒸餾的含量，但隔水蒸餾川芎中藁本內酯含量高于共水蒸餾；脂肪酸類成分，隔水蒸餾當歸川芎的含量大于共水蒸餾當歸川芎，隔水蒸餾提取藥對藁本內酯含量下降，但脂肪酸類含量增多。

圖3各類成分含量

Fig.3 The content of various components

4 討論

4.1揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化 應用Box-Behnken響應面法對當歸川芎藥對提取工藝進行優(yōu)化，實測藥對揮發(fā)油提取率與預測值基本一致。通過對藥對揮發(fā)油的提取工藝進行響應面優(yōu)化，得到藥對揮發(fā)油的最佳提取工藝，所得結果提取率高、重復性好。但揮發(fā)油的提取不僅要重視得率，還應觀察揮發(fā)油的化學成分和生物藥效的變化。

4.2揮發(fā)油GC-MS分析 通過共水蒸餾和隔水蒸餾提取中藥揮發(fā)油，共水蒸餾是將含有揮發(fā)性成分的藥材與水共同蒸餾，使揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出，中藥在水中浸泡時間長，因此芳香性物質會有一部分留在水中，不能被提取出來。隔水蒸餾對芳香性物質較易蒸餾，可加快蒸餾速度，中藥沒有在水中浸泡，因此對芳香性物質損失較少。結果表明，共水蒸餾得到揮發(fā)油的含量、種類高于隔水蒸餾，有可能是藥材在水中浸泡，溶出其他物質所得。

當歸和川芎都為傘形科，所含化學物質有許多相似的，主要功效物質為藁本內酯和芳香酸類成分，這2類物質對心腦血管系統(tǒng)和免疫功能有很好的調節(jié)作用[19]。當歸治療痛經的效果優(yōu)于川芎，但川芎治療血瘀頭痛的效果優(yōu)于當歸；當歸具有潤腸通便、抗輻射損傷的作用，但川芎沒有，川芎具有解熱作用，但當歸卻沒有[20-21]，2種藥材可優(yōu)勢互補。GC-MS分析中，隨著程序升溫，溫度升高，所得化合物相對分子質量變大，成分變復雜。藥對提取揮發(fā)油具有加和性，但并非簡單加和，與單味藥比較，當歸和川芎藥物配伍使揮發(fā)油含量增加，為后續(xù)研究比較提取單味藥揮發(fā)油與藥對揮發(fā)油成分差異提供依據。