王立振，徐宇平，潘棟輝，王辛宇，楊潤(rùn)琳，嚴(yán)駿杰，盛 潔，黃錢煥，楊 敏

(1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214063;2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 211166)

我國(guó)已進(jìn)入“老齡化社會(huì)”，并且老年人口以每年800～1 000萬(wàn)人的速度遞增,人口老齡化呼嘯而至，預(yù)計(jì)2020年將達(dá)到2.43億，2025年將突破3億，2033年突破4億,占總?cè)丝诘?/3[1]。研究表明許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率與人口老齡化密切相關(guān)，如阿爾茲海默氏病、帕金森病等，故其患病人數(shù)也將隨之不斷上升，這些疾病起病隱匿，目前只能根據(jù)臨床癥狀診斷[2]?，F(xiàn)有的藥物、手術(shù)和綜合性治療可以一定程度的緩解癥狀，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)或者停止病情的發(fā)展。因此，研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理，做出早期診斷，早期人為干預(yù)，是延緩這類疾病的唯一有效方法，也是近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)心的一個(gè)重要課題。

多巴胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與運(yùn)動(dòng)、情感和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)[3]。多巴胺系統(tǒng)是近30年來(lái)神經(jīng)科學(xué)研究的焦點(diǎn)問題之一，一些疾病如帕金森病(PD)、精神分裂癥、Tourette 綜合征(TS)、注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)等均與多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙有關(guān)[4]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，多巴胺受體有5種亞型，分別為多巴胺受體D1至D5[5]。其中，多巴胺D2受體(DRD2)的變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性，故對(duì)其研究和應(yīng)用最多[6]。早在上世紀(jì)，就有諸多研究者[7-9]從分子和基因水平探索了年齡和多巴胺D2受體的關(guān)系，然而器官的功能或者疾病的產(chǎn)生和發(fā)展過程遠(yuǎn)不止一個(gè)或幾個(gè)基因調(diào)控。疾病的進(jìn)程受后天環(huán)境的影響遠(yuǎn)比受先天基因的影響明顯，并且這種體外研究無(wú)法實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察體內(nèi)過程，本文運(yùn)用核醫(yī)學(xué)的手段，探索多巴胺D2受體與年齡的關(guān)系。與之前的研究手段相比，多巴胺D2受體的PET顯像能無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、早期、定量地提供活體腦功能信息，為多巴胺D2受體的分布、數(shù)量和密度等變化提供靈敏、有效的手段，為相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床和基礎(chǔ)研究提供更直觀的方法[10]。目前廣泛應(yīng)用的多巴胺D2受體顯像劑主要有11C-raclopride、18F-Fallypride、123I-IBZM、123I-epidepride等[11]。其中，18F-Fallypride與D2受體的特異性結(jié)合更高(Kd=3×10-11mol/L),且18F的半衰期適中，便于臨床應(yīng)用與運(yùn)輸[12]。

本研究制備了多巴胺D2受體顯像劑18F-Fallypride，純化后通過尾靜脈給藥，經(jīng)micro PET顯像，考察18F-Fallypride在正常及老齡SD大鼠紋狀體表達(dá)的差異及各腦分區(qū)的分布，探索衰老與腦多巴胺D2受體的關(guān)聯(lián)性，為利用18F-Fallypride進(jìn)行疾病和藥效研究的方法學(xué)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

Sumitomo HM-7型回旋加速器：日本住友；Mini-Scan TLC薄層放射性掃描儀：美國(guó)Bio SCAN公司；18F-FDG專用合成模塊：北京派特；1525系列分析型高效液相色譜儀、2545系列半制備型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；CURIEMENTOR 3型活度計(jì)：德國(guó)PTW公司；AC 210S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司；Agilent5TC-C18(2)色譜柱：美國(guó)Agilent公司；C18柱、CM柱、QMA柱：美國(guó)Waters公司；microPET:德國(guó)Simens公司；小動(dòng)物麻醉機(jī):SAR-830/P型，美國(guó)CWE公司。

1.2 主要材料與試劑

標(biāo)記前體Fallypride：江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所分子影像中心提供；碳酸鉀乙腈、甲酸、甲醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氧18水：上?；ぱ芯吭?；Kryptofix222(K2.2.2)：美國(guó)Sigma公司；18F-溶液：江原安迪科分子核醫(yī)學(xué)研究發(fā)展有限公司提供；異氟烷：上海雅培制藥有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4只正常SD大鼠：0.18～0.2 kg，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；4只老齡SD大鼠：0.23～0.25 kg，由江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境正常飼養(yǎng)22個(gè)月以上，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0023。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 18F-Fallypride制備及分析

根據(jù)文獻(xiàn)方法[4]按以下步驟制備顯像劑18F-Fallypride，加速器生產(chǎn)的18F離子傳出后吸附于QMA柱上，用K2.2.2/K2CO3洗脫于反應(yīng)管，干燥；加入乙腈，干燥后加入4 mg Fallypride前體，在98 ℃油浴鍋中反應(yīng)20 min；加入8×10-3L 水，通氣攪拌1 min。反應(yīng)液經(jīng)C18柱初步純化除去氟離子后用10 mL水洗C18柱，再用1 mL乙醇淋洗即得濃縮的18F-Fallypride，初產(chǎn)品再經(jīng)半制備型HPLC進(jìn)一步制備純化。HPLC分析檢測(cè)方法如下：色譜柱為Agilent5TC-C18(2)250 mm×4.6 mm分析柱，Waters2545泵，紫外檢測(cè)器(λ=254 nm)，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫，從1 min的70%A和30%B減少到10 min的40%A和60%B，再?gòu)?5 min的40%A和60%B增加到18 min的70%A和30%B，流速為1×10-3L/min，柱溫(30±0.5) ℃。

2.2 microPET顯像

2.2.118F-Fallypride顯像 正常SD大鼠和老齡SD大鼠各4只，尾靜脈注射18F-Fallypride 3.7 MBg/mL，15 min后進(jìn)行microPET顯像，利用異氟烷-氧氣混合氣體(2.5%體積分?jǐn)?shù))麻醉，固定于microPET床板上。層厚0.78 mm，矩陣128×128，采集時(shí)間10 min，采集能窗350～650 keV。

2.2.2數(shù)據(jù)分析處理 microPET顯像圖采用OSEM 3D迭代法重建，ASIProVM軟件勾畫紋狀體為感興趣區(qū)，根據(jù)如下公式計(jì)算SD大鼠每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。%ID/g=感興趣區(qū)域放射性物質(zhì)攝取(μCi/g)/總注射劑量(μCi )×100。PMOD軟件融合圖像，定量分析腦分區(qū)攝取值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 19.0軟件。

2.3 病理實(shí)驗(yàn)

顯像結(jié)束后，腹腔注射10%戊巴比妥鈉1 mL，開胸，心室穿刺灌注預(yù)冷的生理鹽水0.2 L，福爾馬林0.2 L，取全腦，冰凍切片，層厚20 μm，行蘇木素-伊紅(HE)染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察兩組大鼠腦實(shí)質(zhì)及紋狀體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-Fallypride制備及質(zhì)控

18F-Fallypride放射性峰保留時(shí)間為9.57 min，標(biāo)記率>95%，放化純度>98%。PBS和血漿中放置2 h，HPLC檢測(cè)放化純度仍>95%，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[12]。

3.2 microPET顯像

注射15 min后PET顯像顯示老齡SD大鼠雙側(cè)紋狀體，放射性物質(zhì)濃聚高，輪廓清晰，形狀飽滿(圖1)，注射后15 min攝取值達(dá)(0.58±0.11)%ID/g,高于正常SD大鼠(0.39±0.14)%ID/g。PMOD軟件分析圖像(圖2)顯示18F-Fallypride廣泛分布于各腦區(qū)內(nèi)，紋狀體SUV值最高(圖3)，海馬，皮層，丘腦等次之(數(shù)據(jù)列于表1，PMOD分析主要腦區(qū)變化示于圖4)。其中老齡鼠扣帶皮層、島葉、下丘腦、嗅球、中腦等攝取值分別為(0.154±0.013)%ID/g、(0.344±0.014)%ID/g、(0.244±0.019)%ID/g、(0.263±0.020)%ID/g、(0.216±0.012)%ID/g，高于正常大鼠(0.120±0.012)%ID/g、(0.182±0.002)%ID/g、(0.111±0.002)%ID/g、(0.127±0.007)%ID/g、(0.083±0.012)%ID/g。

3.3 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色結(jié)果示于圖5，顯示兩組SD鼠腦實(shí)質(zhì)未見明顯受損，紋狀體染色清晰，正常組神經(jīng)元胞漿豐富、核清晰可見，老齡SD大鼠可見部分神經(jīng)元嗜酸性變或核破碎，偶伴有海綿狀變形、層狀或局灶性神經(jīng)元壞死，其余無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。

a——老齡大鼠；b——正常SD大鼠圖1 大鼠注射18F-Fallypride 15 min后 microPET 顯像圖a——Aged rats；b——Normal ratsFig.1 MicroPET imaging of rats 15 minutes after injection

a——老齡大鼠；b——正常SD大鼠圖2 大鼠PMOD軟件融合圖像a——Aged rats；b——Normal ratsFig.2 Fusion imaging of rats by PMOD

圖3 紋狀體雙側(cè)攝取變化Fig.3 Uptakes of bilateral striatum changes

圖4 PMOD分析主要腦區(qū)變化Fig.4 Main brain region changes analyzed by PMOD

4 小結(jié)

(1) 本研究制備了多巴胺D2受體顯像劑18F-Fallypride，標(biāo)記率高，與文獻(xiàn)報(bào)道相似，穩(wěn)定性好，為動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。

表1 PMOD分析老齡及正常SD大鼠各腦分區(qū)攝取值Table 1 Quantitative analysis of standard uptake values of each brain area in aged and

a——老齡大鼠；b——正常SD大鼠圖5 大鼠HE染色(×400)a——Aged rats；b——Normal ratsFig.5 HE staining of rats (×400)

(2) microPET顯像顯示，18F-Fallypride廣泛分布于腦內(nèi)，其中紋狀體攝取最高，老齡SD大鼠腦分區(qū)攝取普遍高于正常SD大鼠組。

(3) 病理實(shí)驗(yàn)顯示，兩組大鼠腦實(shí)質(zhì)未見明顯受損，其中老齡SD大鼠可見部分神經(jīng)元嗜酸性變或核破碎，偶伴有海綿狀變形、層狀或局灶性神經(jīng)元壞死，可能由于這些病理改變，機(jī)體發(fā)生代償反應(yīng)，導(dǎo)致多巴胺D2受體表達(dá)增高[13]，其余無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，早期輕型帕金森病會(huì)出現(xiàn)多巴胺D2受體上調(diào)[14]， 猜測(cè)這組老齡SD大鼠可能正處于PD早期階段，這一發(fā)現(xiàn)值得進(jìn)一步探索。本研究通過核醫(yī)學(xué)顯像方式考察了正常及老齡SD大鼠腦多巴胺D2受體表達(dá)差異情況，并通過PMOD軟件勾畫詳細(xì)分析了正常及老齡SD大鼠腦各分區(qū)的數(shù)據(jù)，可為臨床早期診斷年齡相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供新的方法。同時(shí)隨著中國(guó)人口老齡化加劇，以及工業(yè)化、城鎮(zhèn)化、生態(tài)環(huán)境及生活方式變化等，阿爾茨海默病、抑郁癥的診治面臨更大的挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步探索發(fā)病機(jī)理，實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療。