馬 媛，石明輝，戴均貴，趙 軍，徐 芳，顧政一

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002；3.中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院藥物研究所,天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA，C30H46O4)是甘草的主要活性成分之一，屬五環(huán)三萜類化合物，由于三萜皂苷母核18位手性碳原子(C-18)構型不同，有α和β2種差向異構體，見圖1。甘草次酸具有廣泛的藥理活性[1-2]，尤其是其衍生物具有抗炎[3-5]、抗腫瘤[6-9]、抗氧化[10]、抗病毒[11-12]和抑菌[13-14]等活性，已被廣泛應用于食品、煙草、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[1]。但長期服用該藥可引起類醛固酮增多癥(pseudo aldosteronism)等不良反應(表現為患者長期用藥后出現水腫、濕疹、低血鉀和鈉潴留等現象)，且其水溶性差，高濃度時對正常細胞有毒性，限制了其在臨床上的廣泛應用。為了改善甘草次酸的溶解性、增強藥理活性并降低和克服上述不良反應，國內外專家對其進行了大量的化學合成[1-2]，此外，近年來開展的采用植物細胞、微生物和酶對甘草三萜類化合物進行結構修飾的研究，已經成為國內外學者研究的熱點，并取得顯著進展[15]。本文綜述了近年國內外有關18β-甘草次酸的結構修飾及生物活性的研究進展。

18α-glycyrrhetinic acid

18β-glycyrrhetinic acid

圖1甘草次酸的化學結構類型

Fig.1 Chemical structure types of glycyrrhetinic acid

1 化學合成

國內外學者利用化學合成方法對18β-甘草次酸從不同的角度進行了結構修飾和改造，合成了大量結構各異的衍生物，研究其不同的藥理活性，取得了顯著的研究成果。

1.1A環(huán)部位修飾的甘草次酸衍生物及活性

1.1.1A環(huán)具有不同官能團衍生物的化學合成 高振北等[16]采用化學合成方法對18β-甘草次酸A環(huán)進行改造，合成了一系列新型18β-甘草次酸A環(huán)官能團化衍生物。構效關系分析表明，A環(huán)內烯鍵的形成對抑制人類腫瘤細胞增殖有重要影響。

1.1.22位羥基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 Chadalapaka G等[17]通過分析構效關系，在18β-甘草次酸A環(huán)C-2位引入一系列吸電子基團合成1-烯-3-氧-甘草次酸衍生物，這些衍生物對人膀胱癌細胞KU7、253JB-V和人胰腺癌細胞Panc-1、Panc-28均有不同程度的抑制活性，尤其是1，2-烯-2-三氟甲基-3-羰基-18β-甘草次酸和1，2-烯-2-氰基-3-羰基-18β-甘草次酸的抗癌效果更優(yōu)。

1.1.33位羥基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 Csuk R等[18]研究發(fā)現，在甘草次酸C-3位引入酰氯等活潑基團，可合成一系列不同碳鏈的C-3位烷胺基取代18β-甘草次酸甲酯衍生物，其中7個碳原子的烷胺基取代的生物活性表現更為出色。

1.1.42位和3位羥基部位同時修飾的甘草次酸衍生物及活性 Gao C等[19]在C-2和C-3位引入各種五元稠合雜環(huán)，得到18個新的GA衍生物，評估了它們對8種不同腫瘤細胞系細胞生長的抑制活性，其中活性最強化合物的半抑制濃度(IC50)為5.19～11.72μmol·L-1，比GA強11倍。研究表明，GA及其衍生物對受試腫瘤細胞的遷移具有抑制作用，尤其是衍生物的抗轉移活性比GA強20倍。

1.2C環(huán)11位羰基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 18β-甘草次酸C環(huán)的結構修飾一般主要集中在C-11位羰基上。羰基通?？梢杂肸n或Zn-Hg齊還原成亞甲基，或硼氫化鈉選擇性還原成羥基，而保留C-30位羧基。

Lin D等[20]將11-羰基還原為11-羥基得到了11-deoxy glycyrrhetinic acid(11-DOGA)，研究發(fā)現，GA和11-DOGA以劑量和時間依賴方式顯著抑制胃癌細胞的生存能力，兩者均可有效抑制裸鼠胃癌細胞腫瘤形成，GA對胃癌細胞的體內和體外毒性均比11-DOGA高。結果表明，對甘草次酸C環(huán)11位羰基的結構修飾能夠有效降低其毒性和不良反應。

1.3E環(huán)30位羧基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 陳湊喜等[21]合成了5個含吡啶雜環(huán)多酰胺結構的18β-甘草次酸衍生物，對其抑制人宮頸癌HeLa細胞活性進行了體外評價，初步發(fā)現目標化合物對人宮頸癌HeLa細胞具有細胞毒活性，能夠有效抑制HeLa細胞增殖、誘導其凋亡，IC50最小值僅為0.02μmol·L-1，均優(yōu)于臨床常用抗腫瘤藥物阿糖胞苷。

Yan T L等[22]合成了一系列新的甘草次酸衍生物，評價了它們對4種癌細胞系(MCF-7、HeLa、HepG2和A-549)的血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)的抑制活性及其抗增殖性能。其中化合物3a(3β-羥基-30-(4-苯基-1-哌嗪基)-齊墩果烷型-12-烯-11，30-二酮)對MCF-7細胞具有最好的抑制活性，也顯示出對VEGFR2酪氨酸激酶最有效的抑制活性。對化合物3a進行了結合模式的對接模擬，結果表明，其能在VEGFR2活性位點處結合。

1.4多環(huán)同時結構修飾的甘草次酸衍生物及活性

1.4.13位羥基部位和(或)30位羧基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 馬紅艷等[23]以18β-甘草次酸為先導化合物，分別通過高溫堿催化構型轉化反應及硫酸催化酯化反應，合成了5個甘草次酸衍生物：18α-甘草次酸(產率63%)、3-乙酰-18β-甘草次酸(產率96%)、3-乙酰-18α-甘草次酸(產率90%)、18β-甘草次酸甲酯(產率79%)和18α-甘草次酸甲酯(產率67%)。2013年木合布力·阿布力孜等[24]和高苗苗等[25]對C-3位和C-30位酯化或酰胺化、C-11位脫氧及C-18βH的構型轉化等進行化學修飾，合成了14個甘草次酸衍生物(包括甘草次酸酯類、酰胺類和11-脫氧衍生物)。

1.4.2其他同時修飾的甘草次酸衍生物及活性

1.4.2.1A環(huán)和E環(huán)同時修飾的甘草次酸衍生物及活性 Gao Y等[26]設計并合成了15個含C-30氮雜環(huán)和不同A環(huán)取代基的新型甘草次酸衍生物，這些衍生物均具有抑制人白血病HL-60細胞的增殖作用。研究發(fā)現，與具有2-羥基亞甲基-3-酮基，異唑或2-氰基-3-酮基的化合物相比，在A-環(huán)上具有氰基-烯酮官能團的化合物表現出更好的生長抑制效果。

孟艷秋等[27]設計并合成了12個甘草次酸C-3和C-30衍生物，并對其體外抗腫瘤活性進行研究。結果表明，上述衍生物對腫瘤細胞MCF-7和A549的抑制活性均明顯強于GA，其中2，3-環(huán)氧-11-氧代-齊墩果烷型-30-羧酸乙酯(GA-I1)、2，3-環(huán)氧-11-氧代-齊墩果烷型-30-羧酸芐酯(GA-I2)和N-[3，11-氧代-齊墩果烷型-12-烯-30-酰]-環(huán)己胺(GA-II1)對MCF-7和A549 2種細胞表現出很好的抑制活性，明顯高于對照藥吉非替尼。

1.4.2.2A環(huán)、C環(huán)和E環(huán)同時修飾的甘草次酸衍生物及活性 Salomatina O V等[8]在A環(huán)引入2-氰基-3-氧代-1-烯部分，在E環(huán)C-30位形成甲酯，同時改變C環(huán)和E環(huán)中的雙鍵和羰基的形成位置，合成了4個甘草次酸的新半合成衍生物，使用鼠類巨噬細胞樣和腫瘤細胞的生物測定顯示，2-氰基-3，12-氧代-齊墩果烷型-30-羧酸甲酯與甲基查爾酮不同，因其C環(huán)中不具有9(11)-雙鍵而表現出對腫瘤細胞的抑制活性和抗炎的高選擇性。

Li X等[28]合成了14個具有C環(huán)不同結構的2-氰基-3，12-二氧代-18β-齊墩果烷型-1，9(11)-二烯-30-酸(CDODO-Me-12)類似物，以確定抑制人白血病HL-60細胞生長和誘導細胞凋亡的活性基團。C環(huán)中的不飽和基團需要維持抑制細胞生長和誘導凋亡的能力?；衔?-氰基-3-氧代-9(11)，12-二烯-齊墩果烷型-30-羧酸甲酯C環(huán)中具有9(11)，12-二烯，與c-FLIP水平降低相關的CDODO-Me-12相比，表現出顯著的細胞凋亡誘導能力，但與Mcl-1和XIAP無關。它具有降低GSH消耗的能力，能代表通過與CDODO-Me-12不同的機制起作用的新活性化合物。

孟艷秋等[29]對甘草次酸C-3、C-11和C-30進行結構修飾，設計并合成了7個目標產物，抗腫瘤活性篩選結果表明，3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸乙酯對腫瘤細胞MCF-7的抑制率比母體顯著提高，3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸乙酯、3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸正丙酯和3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸正丁酯對腫瘤細胞A549的抑制率均比母體有所提高。陳蘭等[30]對甘草次酸C-3、C-11和C-30進行結構修飾，合成了6個目標產物，經過鑒定確認了其化學結構。

唐百達等[31]對18β-甘草次酸A環(huán)、11位羰基及30位羧基進行結構修飾，設計并合成了20個2-取代-3-氧代-齊墩果烷型-12-烯-30-酰胺類化合物。這些衍生物對PC-3細胞顯示了不同程度的生長抑制活性，明顯好于其母體化合物，其中N-(2-氰基-18β-齊墩果烷型-1，12-二烯-30-?；?哌啶的活性最強。構效關系表明，A環(huán)引入2-氰基-3-氧代-1-烯的化合物活性最好，2位引入羥亞甲基與2，3位駢合異惡唑環(huán)類化合物活性相當，2位引入氰基的化合物活性較弱；30位羧基與哌啶及哌啶基哌啶成酰胺活性較好，與 4-甲基哌嗪、嗎啉和哌嗪成酰胺活性較弱。

黃敏等[32]為了探討18β-甘草次酸C環(huán)雙鍵位置對其抗腫瘤活性的影響，設計并合成了新型C環(huán)上具有9(11)-烯基結構的化合物，以此C環(huán)骨架對A環(huán)及30位羧基進行結構修飾，共24個GA衍生物，并測定了它們對人前列腺癌PC-3和白血病HL-60細胞的體外抑制活性。結果表明，大多數衍生物對上述細胞顯示出比GA更強的生長抑制活性，尤以2-氰基-3-氧代-齊墩果烷型-1，9-雙烯-30-羧酸甲酯的活性最強。

Zou L W等[33]將GA的11-氧代-12-烯轉化為12-二烯部分，將C-3羥基和C-30羧基分別轉化成3-O-β-羧基丙?；鸵一?，得到了一系列GA衍生物，致使先導化合物18β-GA對人羧酸酯酶2(hCE2)和hCE1的選擇性抑制作用顯著增強。

2 生物轉化

生物轉化(biotransformation)是利用微生物、動植物的培養(yǎng)體系或其產生的酶制劑對外源性化合物進行結構修飾而獲得有價值產物的生物化學反應過程，亦稱為生物催化(biocatalysis)，其本質是利用生物體系本身所產生的酶對外源性化合物進行酶催化反應，反應類型有水解、羥基化和糖基化等，具有高度的立體和位置選擇性、反應條件溫和、催化效率高、反應類型多和不污染環(huán)境等特點。采用生物轉化方法可進行化學法相對較難進行的反應，從中尋找并獲得新的高活性或低毒性的天然活性先導化合物，是創(chuàng)制藥物新分子的重要手段之一[15]。

2.1植物組織細胞培養(yǎng)

2.1.1以植物組織細胞作為生物轉化體系 將植物組織細胞培養(yǎng)應用于甘草中有效成分的生物轉化，具有重復性好、材料充足和周期短等優(yōu)點。Orihara Y等[34]用桉樹的細胞懸浮培養(yǎng)液轉化18β-GA，得到2個產物，即28-羥基-18β-甘草次酸-30β-吡喃葡萄糖酯和23，28-二羥基-18β-甘草次酸-30β-吡喃葡萄糖酯。這種游離懸浮細胞的生物轉化系統具有直接使用前體、細胞轉移限制少、不存在影響細胞活力和生理狀態(tài)等優(yōu)點，是目前使用最多的一個轉化系統。

2.1.2以毛狀根作為生物轉化體系 相對于懸浮細胞，毛狀根具有生長快速、加倍時間短、遺傳和生化穩(wěn)定的特點。Asada Y等[35]利用人參毛狀根具有糖基化和丙二?；纳镛D化能力，對18β-GA進行生物轉化，由于18β-GA的C-3位羥基、C-30位連有羧基，利用人參毛狀根培養(yǎng)能使其糖基化和丙二?；玫?個轉化產物。

2.2微生物轉化 Qin Y J等[36]用短刺小克銀漢霉(Cunninghamellablakesleeana)轉化GA，得到2個主產物和4個次主產物。2個主產物鑒定為3-酮基-7β-羥基甘草次酸和7β-羥基甘草次酸，并篩選了底物及2個主產物的抑菌活性。結果表明，短刺小克銀漢霉AS 3.970對GA具有羥基化作用，GA和2個主產物對耐藥菌糞腸球菌具有良好的抑菌活性。

馬媛等[37-38]和Ma Y等[39]利用52種微生物進行18β-GA的微生物轉化研究，經檢測發(fā)現10種真菌對GA有不同程度的轉化，選擇短刺小克銀漢霉CGMCC 3.970對GA進行微生物轉化的放大實驗，經純化和制備最終獲得 18 個甘草次酸衍生物，其中 12 個為新化合物。結果提示短刺小克銀漢霉CGMCC 3.970對GA具有選擇性酮基化、羥基化及?；饔?，藥理活性實驗結果顯示，所得衍生物中7β，15α-二羥基-18β-甘草次酸的體外神經保護活性最強，其IC50值為0.000 45μmol·L-1，甚至比甘草酸的活性更強。

2.3酶水解轉化 吳少杰等[40]分別利用酶水解法及液體發(fā)酵轉化法制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸，酶水解法產物的產率為23.7%，液體發(fā)酵法的產率為10%。由此可知，利用酶水解法轉化甘草次酸，可顯著提高目標化合物的轉化率。直接以酶為反應體系的生物轉化，是獲得單一目標產物的有效途徑，具有方便、快捷、產率高的優(yōu)勢，在工業(yè)化生產中具有應用價值。

3 結語

甘草次酸的生物轉化一直是國內外研究的熱點，然而目前基本上處于實驗室研究階段，未能實現產業(yè)化，國內對其研究剛剛起步，但其作用不可忽視，今后需要加大研究力度，逐步了解其生物轉化的途徑、反應的特點和條件，尋找新的、藥理活性更強的化合物，進而研制新藥。大量研究表明，用微生物轉化18β-甘草次酸具有廣闊的應用前景，獲得的目標組分多，但要獲得專一性強的微生物轉化菌株和適宜的轉化條件較為困難。加強菌株篩選及簡便、快捷的轉化條件研究，對利用微生物轉化甘草次酸的工業(yè)化生產具有重要意義。