牛宇東，張 鑫，葛西航

(1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054；2.陜西大德醫(yī)藥有限公司，西安 710075)

綠袍散是由青黛、黃柏、山豆根、薄荷、黃連、兒茶、人中白、硼砂和冰片[1]9味藥研成細(xì)粉制成的散劑，主治唇舌糜爛、咽喉腫痛等，具有清熱降火、消腫止痛的作用。方中青黛為君藥，具有清熱解毒、清肝瀉火的作用[2-3]，再配以黃柏、黃連可清熱燥濕、降火解毒[4-5]。由于青黛藥材加工復(fù)雜，產(chǎn)量低，易出現(xiàn)摻假造假染色等現(xiàn)象，會(huì)影響藥效，目前綠袍散僅有幾個(gè)簡單的化學(xué)反應(yīng)和散劑的通則作為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。筆者認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)具有一定的缺陷，定性鑒別不能反映藥品的真實(shí)質(zhì)量，因此對處方中君藥青黛增加含量測定項(xiàng)目。青黛的主要活性成分為靛藍(lán)和靛玉紅，目前對其測定主要有TLC掃描法[6-8]，紫外分光光度法[9-11]和HPLC法[12-18]等，本實(shí)驗(yàn)參考上述文獻(xiàn)和《中國藥典》[19]，擬建立同時(shí)測定綠袍散中靛藍(lán)和靛玉紅的含量，作為成藥中青黛的質(zhì)量控制方法，可以更全面地反映綠袍散的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，四元洗脫泵，UV檢測器(美國安捷倫儀器公司)；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；BT124S型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))；KQ-70VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 綠袍散(西安順康制藥有限公司，規(guī)格：瓶質(zhì)量1.5 g，批號(hào)：170704，170801，170802)；對照品：靛藍(lán)(批號(hào)110716-200610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)，靛玉紅(批號(hào)110717-200204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)，均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；磷酸，丙酮，氯仿和N，N-二甲基甲酰胺等均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(73∶27)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：288 nm；進(jìn)樣量：5 μL，在上述色譜條件下測定對照品、供試品溶液及陰性樣品溶液。理論塔板數(shù)以靛藍(lán)峰計(jì)算不低于14 500，分離度>1.5，色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取靛藍(lán)對照品4.91 mg，置于25 mL量瓶中，加DMF超聲溶解后稀釋至刻度；精密稱取靛玉紅2.52 mg，置于250 mL量瓶中，加DMF超聲溶解后稀釋至刻度，作為對照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述靛藍(lán)和靛玉紅儲(chǔ)備液5 和0.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，作為對照品溶液(靛藍(lán)和靛玉紅質(zhì)量濃度分別為98.20和2.52 μg·mL-1)。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取綠袍散樣品(批號(hào)170704)0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用N，N-二甲基甲酰胺補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜0.45 μm濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4陰性樣品溶液的制備 按照綠袍散處方工藝和處方量的1/10制備缺青黛藥材的陰性樣品，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，同法制成陰性樣品溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品溶液各5 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，見圖1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青黛藥材的陰性樣品對靛藍(lán)和靛玉紅的測定無干擾。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.靛藍(lán)；2.靛玉紅。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.indigotin；2.indirubin.

2.5線性關(guān)系的考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的對照品溶液1，2，5，10，15和20 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣的質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)(x)、相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果靛藍(lán)質(zhì)量在98.20～196.40 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.960 5x+44.359 0，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4；靛玉紅質(zhì)量在2.52～50.40 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.157 5x+0.537 1，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1，10和20 μL，各6次，進(jìn)行測定，結(jié)果表明，對照品溶液中靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的RSD值分別為0.46%和1.19%，均在2%之內(nèi)，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0，1，2，4，8，12和24 h測定，進(jìn)樣量為5 μL，連續(xù)考察24 h，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的RSD值分別為1.39%和2.36%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取綠袍散樣品(批號(hào)170704)，按照2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測定，計(jì)算6份樣品中靛藍(lán)和靛玉紅的RSD值分別為0.73%和1.24%，結(jié)果表明，供試品溶液穩(wěn)定，該方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的綠袍散樣品(批號(hào)170704)6份，每份0.1 g，另精密稱取靛藍(lán)對照品16.86 mg，置于25 mL量瓶中，作為對照品溶液，分別往上述6份樣品中各精密加入上述靛藍(lán)對照品溶液3 mL，靛玉紅儲(chǔ)備液1 mL，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別計(jì)算靛藍(lán)和靛玉紅的回收率，結(jié)果見表1。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test(n=6)

成分取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%靛藍(lán)0.102 32.174 42.023 24.100 5 95.294.81.40.101 62.159 62.023 24.095 8 95.70.103 92.208 42.023 24.092 0 93.10.101 82.163 82.023 24.118 2 96.60.100 82.142 62.023 24.042 4 93.90.102 62.180 82.023 24.086 7 94.2靛玉紅0.102 30.057 70.056 50.108 7 90.290.01.10.101 60.057 40.056 50.108 0 89.60.103 90.058 70.056 50.108 9 88.90.101 80.057 50.056 50.107 9 89.20.100 80.056 90.056 50.108 5 91.40.102 60.057 90.056 50.109 1 90.7

2.10樣品含量測定 分別取不同批號(hào)的綠袍散樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批樣品平行制備2份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算3批樣品中靛藍(lán)和靛玉紅的含量，結(jié)果(批號(hào)170704、170801和170802樣品中靛藍(lán)和靛玉紅的含量分別為21.255 5和0.564 5，20.907 8和0.558 8，21.073 9和0.565 0 mg·g-1。

3 結(jié)果與討論

3.1溶劑的選擇 《中國藥典》中靛藍(lán)的溶劑采用氯仿，靛玉紅則是N，N-二甲基甲酰胺，由于氯仿對靛玉紅的溶解性較差，實(shí)驗(yàn)比較了氯仿、甲醇、丙酮及N，N-二甲基甲酰胺分別作為提取溶劑對綠袍散中靛藍(lán)和靛玉紅含量測定的影響。結(jié)果顯示，選用N，N-二甲基甲酰胺作為提取溶劑，綠袍散中靛藍(lán)和靛玉紅的含量最高，因此本實(shí)驗(yàn)選用N，N-二甲基甲酰胺作為供試品溶液的提取溶劑。

3.2測定波長的選擇 實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)對靛藍(lán)、靛玉紅和供試品溶液分別在400～260 nm之間進(jìn)行全波長掃描，由光譜圖可以看出靛藍(lán)的最大吸收波長為423，333和288 nm，靛玉紅的最大吸收波長為363和293 nm，供試品溶液的最大吸收波長為423，336和284 nm，實(shí)驗(yàn)分別在288和293 nm處進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對靛藍(lán)的含量測定影響較大，對靛玉紅的含量影響不大，且靛藍(lán)的最大紫外吸收與供試品溶液的最大吸收接近，由于樣品中靛藍(lán)的含量高，因此根據(jù)供試品溶液和對照品溶液的光譜圖比較，并參考《中國藥典》青黛藥材項(xiàng)下對其含量測定的條件，確定實(shí)驗(yàn)檢測波長為288 nm。

3.3耐受性考察 實(shí)驗(yàn)對供試品溶液測定中的不同波長、流速、柱溫、色譜柱和流動(dòng)性比例進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對靛藍(lán)和靛玉紅的保留時(shí)間和分離度均有影響，對峰面積和含量測定結(jié)果均無顯著性影響，因此需要對其波長、流速和柱溫等進(jìn)行控制，同時(shí)采用安捷倫1260、島津LC-10A和賽默飛Ultimate3000不同型號(hào)的高效液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者含量測定值的RSD<1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不影響測定結(jié)果。

3.4結(jié)果的判定 《中國藥典》2015年版規(guī)定青黛藥材中靛藍(lán)不得少于2.0%，靛玉紅不得少于0.13%，綠袍散處方中的青黛藥材占27.74%，按照處方比例青黛中靛藍(lán)的含量應(yīng)不低于5.548 mg·g-1，靛玉紅不低于0.361 mg·g-1，實(shí)驗(yàn)測定3批樣品的結(jié)果中靛藍(lán)和靛玉紅含量分別為20.907 8～21.255 5和0.558 8～0.565 0 mg·g-1，均符合藥典要求，因此本實(shí)驗(yàn)建立的方法可作為該散劑中青黛的質(zhì)量控制方法，該方法操作簡單、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)，可為綠袍散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。