趙文娜，白 靜，周 凱，車曉俠，張愛軍，王清暉，張抗懷

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安 710004)

化生平合劑是我院自主研發(fā)的治療萎縮性胃炎癌前病變的非標準制劑，具有健脾益氣、活血化瘀和清熱解毒的功效，由黃芪、黨參、丹參、虎杖、黃連、莪術(shù)、雞內(nèi)金、白花蛇舌草、三七和甘草等組成。本制劑已在臨床應(yīng)用20余年，療效確切[1-2]。但原制備工藝和質(zhì)量標準制定已不能滿足現(xiàn)代制劑的要求，有必要對其進行二次開發(fā)，提高其質(zhì)量控制水平。因此，本文對其處方中的丹參和虎杖應(yīng)用TLC法進行了定性鑒別，并對其主要活性成分大黃素和丹參酮ⅡA應(yīng)用HPLC法進行了定量測定，所建立的方法簡便、準確、重復(fù)性好，可為該制劑的質(zhì)量控制和評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括其工作站、自動進樣器和1260-VWD紫外檢測器(美國安捷倫科技公司)；METTLER-TOLEDO XS 105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Sartorius BT 25S型精密分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-300TDB高頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 大黃素對照品(批號110756-201512)，大黃素甲醚對照品(批號110758-201415)，丹參酮ⅡA對照品(批號110766-201520)，虎杖對照藥材(批號120980-201005)，丹參對照藥材(批號120923-201414)，均購自中國食品藥品檢定研究院；化生平合劑 (西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，批號：151027，160524和170418)；水為超純水；甲醇(HPLC級)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，成都科龍化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC定性鑒別

2.1.1虎杖 取本品溶液20 mL，加三氯甲烷30 mL，超聲處理20 min，濾過。濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇使其溶解，作為供試品溶液。按照化生平合劑的制備工藝制備不含虎杖的陰性溶液，并按照供試品溶液的制備方法進行處理，作為陰性對照溶液。另取虎杖對照藥材0.5 g，加三氯甲烷20 mL，同法制成對照藥材溶液。取大黃素和大黃素甲醚對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)實驗，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，分別置于日光及紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性溶液在相應(yīng)位置上未見明顯斑點，陰性溶液無干擾，可有效鑒別虎杖。見圖1A。

圖1TLC圖

A.虎杖：1.大黃素、大黃素甲醚對照品；2.虎杖對照藥材；3～5.虎杖供試品溶液；6.陰性對照溶液。B.丹參：1.丹參酮ⅡA對照品；2.丹參對照藥材；3～5.丹參供試品溶液；6.陰性對照溶液。

Fig.1 TLC chromatograms

A.Polygonumcuspidatum： 1.emodin and emodin ether reference solution；2.Polygonumcuspidatumcontrol solution ofPolygonumcuspidatum；3-5.sample solution ofPolygonumcuspidatum；6.negative control solution.B.Salviamiltiorrhiza：1.tanshinone ⅡA reference solution；2.Salviamiltiorrhizacontrol solution；3-5.sample solution ofSalviamiltiorrhiza；6.negative control solution.

2.1.2丹參 取本品20 mL，加乙醚30 mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。按照化生平合劑的制備工藝制備不含丹參的陰性溶液，并按照上述供試品溶液的制備方法處理，作為陰性對照溶液。另取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)實驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(35∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的暗紅色斑點。陰性溶液在相應(yīng)位置上未見明顯斑點，陰性溶液無干擾，可有效鑒別丹參。見圖1B。

2.2含量測定

2.2.1溶液的制備 混合對照品溶液：精密稱取大黃素和丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為78.2和10.8 μg·mL-1的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

供試品溶液：精密量取化生平合劑25 mL，水浴蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，過濾，濾液蒸干，用甲醇定容至1 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，進行HPLC分析前用 0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，即得。

陰性對照溶液：取化生平處方中除虎杖和丹參外的其余藥材，按照制劑工藝制成陰性樣品，按照上述供試品溶液制備方法制備得陰性對照溶液。

2.2.2色譜條件 采用Kromosil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-水(75∶25)為流動相；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；紫外檢測波長為270 nm。

2.2.3系統(tǒng)適用性實驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按照2.2.2項下色譜條件進樣10 μL，見圖2，藥品中其他色譜峰對大黃素和丹參酮ⅡA色譜峰無干擾，且目標色譜峰能達到基線分離，峰形尖銳，基線平穩(wěn)。

圖2HPLC圖

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.大黃素；2.丹參酮ⅡA。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference solution；B.sample solution；C.negative control solution；1.emodin；2.tanshinone ⅡA.

2.2.4線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2，6，10，14，18和20 μL，按照2.2.2項下色譜條件進樣分析，以進樣量為橫坐標(x)、峰面積積分值為縱坐標(y)繪制標準曲線，其回歸方程分別為：y=3 329.7x+10.992 4，r=0.999 8；y=5 831.8x+3.212 3，r=0.999 9，結(jié)果表明大黃素和丹參酮ⅡA在0.156 4～1.564和0.021 6～0.216 μg范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度實驗 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，重復(fù)進樣6次，進樣量為10 μL，分別記錄大黃素和丹參酮ⅡA的峰面積，計算RSD值分別為1.35%和1.66%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液(批號170418)，按照2.2.1項下方法制備供試品溶液，分別于制備后 0，1，2，4，6和24 h按照2.2.2項下色譜條件進樣測定，計算得RSD值為1.83%，結(jié)果表明，該樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性考察 取同一批次化生平樣品(批號170418)，按照2.2.1項下方法平行制備6份供試品溶液，測定大黃素和丹參酮ⅡA的峰面積并分別記錄，計算得RSD值分別為1.85%和1.96%。

2.2.8加樣回收率實驗 精密量取已知含量的化生平樣品15 mL(批號170418)5份，分別精密加入質(zhì)量濃度為80.5和4.8 μg·mL-1的大黃素和丹參酮ⅡA混合對照品溶液1.0 mL，按照2.2.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2.2項下色譜條件進樣測定，分別計算回收率。結(jié)果大黃素的平均回收率為98.42%，RSD值為1.11%，丹參酮ⅡA的平均回收率為103.29%，RSD值為1.54%。見表1。

表1加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of recovery experiment(n=5)

成分樣品中量/μg加入量/μg測得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%大黃素97.3580.50175.4898.6798.421.1197.3580.50173.5397.5797.3580.50176.2999.1297.3580.50172.5397.0197.3580.50177.3599.72丹參酮ⅡA3.604.808.83105.12103.291.543.604.808.49101.073.604.808.62102.623.604.808.69103.453.604.808.75104.17

2.2.9樣品含量測定 精密量取不同批號(151027，160524和170418)的樣品25 mL，按照2.2.1項下方法制備供試品溶液，用微孔濾膜過濾后按照2.2.2項下色譜條件進樣分析。把大黃素和丹參酮ⅡA的峰面積積分值帶入標準曲線方程計算不同批次藥品中的含量。結(jié)果3批化生平樣品中大黃素和丹參酮ⅡA的含量分別為6.05和0.19，6.36和0.21以及6.49和0.24 μg·mL-1。

3 討論

胃癌是一種全球高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其病死率僅次于肺癌和肝癌，高居第3 位。中國每年胃癌新發(fā)病例數(shù)達40萬例，占世界新發(fā)病例數(shù)的42%，病死率和發(fā)病率位于全球前20位，高于世界平均水平[3-4]。相關(guān)研究證實，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多因素、多基因變異累積的結(jié)果，存在著一系列的中間過程，即慢性非萎縮性胃炎→慢性萎縮性胃炎腸上皮化生→胃黏膜異形增生→早期胃癌→進展期胃癌這一模式[5-6]。目前，提高胃癌的生存率主要依靠預(yù)防，即有效防治胃癌癌前病變[7]。中醫(yī)認為胃癌癌前病變可歸屬于胃脘痛、心下痞硬和痞滿等范疇，而健脾益氣、調(diào)氣活血和清熱化濕解毒是其治療的根本方法[8-10]?；胶蟿┨幏揭越∑⒁鏆?、活血化瘀和清熱解毒立法，其中黃芪和黨參具有健脾益氣的作用，王娜等[11]和車曉俠等[12]雖然建立了化生平中黃芪主要成分黃芪甲苷的含量測定方法，但樣品前處理要經(jīng)過萃取、過柱以及反復(fù)洗脫，步驟冗繁，耗時耗力，易造成誤差，且檢測波長在203 nm處其他物質(zhì)吸收對黃芪甲苷吸收峰干擾較大。因此，在化生平合劑的二次開發(fā)中我們對處方中發(fā)揮活血化瘀、清熱解毒作用的丹參和虎杖的指標性成分丹參酮ⅡA和大黃素進行了含量測定。

樣品的處理：參照《中國藥典》虎杖和丹參項下的樣品處理方法[13]，取化生平合劑適量，用三氯甲烷和硫酸溶液提取，提取液蒸干后用甲醇溶解，過濾，進樣后發(fā)現(xiàn)只有大黃素出峰，丹參酮ⅡA不出峰，將樣品蒸干后直接用甲醇提取，2個目標峰均出現(xiàn)，且供試品中其他雜質(zhì)峰對目標峰無干擾，操作簡便。

流動相和檢測波長的選擇：參照《中國藥典》及相關(guān)文獻方法[13-19]，分別用乙腈-1 mL·L-1磷酸水(22∶78)、甲醇-1 mL·L-1磷酸水(80∶20)、甲醇-1 mL·L-1磷酸水(75∶25)和甲醇-水(75∶25)作為流動相進行考察，發(fā)現(xiàn)在甲醇-水(75∶25)流動相條件下，其他雜質(zhì)峰對大黃素和丹參酮ⅡA均無干擾，重復(fù)性好、方法簡便。在波長254 nm處進行HPLC分析，丹參酮ⅡA色譜峰面積比在270 nm條件下低，而大黃素吸收峰影響不大，因此選用270 nm作為檢測波長。

綜上所述，本研究所建立的測定方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性良好，可用于化生平合劑的質(zhì)量控制。