周恒君， 熊 艷， 龔 云， 戴勇琦， 張 俊， 徐常利， 呂立華， 吳學文

(1.湘潭大學 化工學院，湖南 湘潭 411105；2.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412003；3.邵陽學院 藥學院，湖南 邵陽 422000)

糖尿病是一種常見代謝性疾病，其并發(fā)癥如心臟、血管、腎臟、視網(wǎng)膜和神經(jīng)病變等，對人體有極大的危害，可引起心腦血管疾病、慢性腎病，甚至失明、截肢.糖尿病及其并發(fā)癥不僅危害患者身體健康，影響患者家庭生活質量，而且是加重社會負擔及制約國家經(jīng)濟發(fā)展的重要因素[1].據(jù)WHO統(tǒng)計，全球共有4.22億糖尿病患者，每年有120 萬人死于糖尿病相關疾病.據(jù)文獻報道，目前糖尿病病例90%以上屬于Ⅱ型糖尿病[2].西藥在短時間內降血糖可取得較好效果，但多局限于單靶點，長期使用存在嚴重不良反應，無法有效控制糖尿病并發(fā)癥.中藥雖然在降血糖方面短時間內效果不如西藥，但在治療中具有多成分、多靶點和多向性作用，不僅有降血糖作用，而且有控制糖尿病并發(fā)癥的能力[3].

目前，中醫(yī)治療糖尿病主要奉行“活血、益氣、養(yǎng)陰、清熱”[4].通過歸納、總結中醫(yī)治療Ⅱ型糖尿病用藥處方規(guī)律，發(fā)現(xiàn)高頻藥為補氣、活血化瘀、清熱藥，其中當歸、益母草出現(xiàn)頻率位居前十[5-6].故我們推測 “當歸-益母草”藥對具有抗Ⅱ型糖尿病作用，但其物質基礎和作用機理均不明確.“當歸-益母草”是經(jīng)典的氣血雙補藥對，具有獨特的配伍意義，沿用至今.該藥對來自《竹林寺女科密方》記載的益母丸，該方由益母草、當歸組成，是一種治療婦科疾病的傳統(tǒng)古方，具活血調經(jīng)，氣血雙補，祛瘀生新作用.《本草綱目》云：“益母草行血養(yǎng)血，行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血，誠為血家之圣藥也.”當歸被稱為“補血要藥”，其補血作用得到歷代醫(yī)家公認，具補血活血、調經(jīng)止痛的功能[7].中醫(yī)婦科臨床經(jīng)典用藥如補血益母顆粒、八珍益母丸、四物益母丸等都以“當歸-益母草”藥對為基礎組方而成.因此研究“當歸-益母草”藥對抗Ⅱ型糖尿病物質基礎及作用機制對挖掘、開發(fā)含此藥對的中醫(yī)婦科經(jīng)典名方有重要意義.

近年來，網(wǎng)絡藥理學為新靶點、新機制的新藥發(fā)現(xiàn)提供了全新手段[8].同時，采用網(wǎng)絡藥理學方法如系統(tǒng)生物學、網(wǎng)絡分析等手段可預測傳統(tǒng)藥方藥理作用[9].本項研究中，我們以網(wǎng)絡藥理學手段，研究“當歸-益母草”經(jīng)典藥對抗Ⅱ型糖尿病的物質基礎及分子機制，并從整體的角度探討“當歸-益母草”與Ⅱ型糖尿病的生物網(wǎng)絡.

1 材料和方法

1.1 藥對的化學成分數(shù)據(jù)庫建立

益母草(leonuri herba)、當歸(angelicae sinensis radix)化學成分均收集自文獻和公共數(shù)據(jù)庫：CSDB化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫、TCMSP數(shù)據(jù)庫和Drug數(shù)據(jù)庫,共計收集到170個化學成分.以 (OB)>30%[10]和 (DL)>0.04[11]為標準篩選候選化合物，共計135個化合物符合條件，包括黃酮類、苯丙素類、甾醇綠原酸類化合物等.其中從當歸中篩選到74個化學成分(M1～M74)，益母草中有81個成分(M75～M135)符合標準.在數(shù)據(jù)庫中下載益母草、當歸所含化學成分分子結構.考慮到口服藥物，糖苷會在腸道內酶解脫糖[12]，根據(jù)糖苷酶水解反應的規(guī)律，對其中含9個糖基化合物進行處理，得到4個新化學成分.

1.2 靶點預測和確認

PharmMapper是利用藥效團映射方法識別潛在藥物靶標的WEB服務器[13].將藥對化學成分數(shù)據(jù)庫的結構信息輸入PharmMapper篩選相關蛋白質功能信息，其中，將蛋白質名稱與物種限制為“人類”，采用官方標志命名所采集的蛋白質，如P35354，O95433等.從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫和UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索候選靶點的晶體結構并下載蛋白質的結構；如無對應蛋白質晶體結構，則使用瑞士模式自動蛋白質建模服務器進行建模，并保存為PDB文件.經(jīng)過這一系列操作，最終構建靶點信息數(shù)據(jù)庫.

為進一步確認靶點的可靠性，采用Auto Dock軟件將活性成分和候選靶點模擬對接，其中參數(shù)默認設置及所有配體原子允許旋轉[14].采用Lamarckian遺傳算法評估分子-靶點相互作用[15]，以對接分數(shù)<-5.0 kcal/mol為指標篩選潛在靶點，并進一步利用已知小分子配體的X射線結構驗證對接的可靠性.

1.3 網(wǎng)絡構建與MCODE插件富集

采用網(wǎng)絡可視化軟件Cytoscape構建分子網(wǎng)絡，并分析“當歸-益母草”藥對“藥物-靶點”網(wǎng)絡(drug-target, D-T network)及“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(drug-target-disease, D-T-D network)[16].將藥對化學成分數(shù)據(jù)庫及“藥物-靶點”對接結果導入軟件以完成相關網(wǎng)絡構建，用“節(jié)點”(node)表示活性成分、靶點，用“邊”(edge)表示活性成分與靶點之間的關系；然后采用MCODE插件富集，以明確“當歸-益母草”藥對抗Ⅱ型糖尿病重要的活性成分和關鍵靶點，同時跟蹤文獻以分析其中的相互作用.

2 結 果

2.1 藥物-靶點網(wǎng)絡分析

D-T network如圖1所示，根據(jù)“當歸-益母草”藥對候選活性成分數(shù)據(jù)庫及其潛在靶點構建“藥物-靶點”相互作用網(wǎng)絡圖(圖1)，該網(wǎng)絡共由573個節(jié)點(135個候選化合物和438個候選靶點)和1 528個邊組成，其中三角形節(jié)點代表活性成分，圓形節(jié)點代表靶點，邊代表相互作用關系.外圍靶點表示與活性成分的相互作用小，圈內靶點表示和多個活性成分有關聯(lián)，提示這些高頻靶點可能是關鍵靶點.

2.2 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡

網(wǎng)絡藥理學研究中，“藥物-靶點-疾病” 網(wǎng)絡常用來揭示活性成分及作用機制.從I2D數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫檢索與Ⅱ型糖尿病相關的靶點，使用MCODE插件從“藥物-靶點”網(wǎng)絡分析構建D-T-D網(wǎng)絡(圖2).該網(wǎng)絡由76個節(jié)點(32個候選化合物、43個候選靶點和疾病)和231個邊組成，其中三角形節(jié)點代表活性成分，圓形節(jié)點代表藥對共同作用的靶點，棱形代表益母草作用靶點，六邊形代表當歸的靶點，邊代表相互作用關系.

表1 “當歸-益母草”藥對的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡分子節(jié)點及其參數(shù)(分子節(jié)點degree≥5)

表2 “當歸-益母草”藥對的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡節(jié)點及其參數(shù)(靶點節(jié)點degree≥4)

1)：a為當歸(angelicae sinensis radix)，l為益母草(leonuri herba).

表1、表2中列出了關鍵靶點及重要活性成分的degree.表1顯示D-T-D網(wǎng)絡中共有17個關鍵活性成分(degree≥5)，其中有6個黃酮類化合物，如槲皮素(M132)擁有17個靶點， 其次是芹菜素(M87)擁有14個靶點, 山奈酚(M123)擁有11個靶點, 大豆異黃酮(M78)擁有10個靶點，提示這些黃酮類化合物可能是抗Ⅱ型糖尿病物質基礎.如表2所示，D-T-D網(wǎng)絡中有15個關鍵靶點(degree≥4)，如P35354(prostaglandin G/H synthase 2)受31種活性成分的調節(jié)，P23219受31種化合物的調節(jié)，P27338受20種化合物的調節(jié)，P21397受13種化合物的調節(jié).有意思的是，極高頻靶點(degree≥10)除P27487只受控于益母草活性成分外，其余都同時由當歸-益母草藥對活性成分調節(jié).以上結果說明“當歸-益母草”藥對有抗Ⅱ型糖尿病物質基礎，且具多成分、多靶點協(xié)同作用的特征.

3 討 論

通過網(wǎng)絡藥理學方法構建的D-T-D網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)該藥對活性成分和靶點與Ⅱ型糖尿病之間存在一定的聯(lián)系.Ⅱ型糖尿病是一種多器官多靶點慢性疾病，胰島素抵抗和胰島細胞功能減退是發(fā)病的兩個關鍵因素.Ⅱ型糖尿病易引發(fā)高血糖和高血壓等并發(fā)癥，多數(shù)患者存在脂代謝紊亂，表現(xiàn)為血清中膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)增高的高血脂病癥等[17].在中藥診斷中主要表現(xiàn)為氣陰虧虛、熱盛傷津，同時還伴有淤血等癥狀.研究發(fā)現(xiàn)，血脂異?；颊叱：喜⑻悄虿18]，而且血脂水平越高，其血糖水平也越高，發(fā)生糖尿病的風險越高[19].

據(jù)報道，槲皮素(M132)能直接刺激INS-1細胞分泌胰島素(P01308)[20].槲皮素還能間接改善STZ糖尿病大鼠的高血糖、高甘油三酯血癥和高膽固醇癥狀[21]，通過減輕Ⅱ型糖尿病小鼠的自由基和氧化應激反應改善高血糖[22].阿魏酸(M34)能激活前列腺素G/H合酶1(P23219)和前列腺素G/H合酶2 (P35354)，增加前列腺素( PGI2 )的生物活性，使PGI2 /TXA2的值升高，從而抑制血小板凝聚.阿魏酸還可抑制肝合成膽固醇，降低血脂[23].TC、LDL 和 TG 與空腹血糖呈正相關，HDL與空腹血糖呈負相關[24]，β-谷甾醇(M32)可明顯降低血清總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平[25]，其作用機理是通過抑制膳食和膽汁中的膽固醇的吸收，從而達到降膽固醇的效果[26].動物實驗表明，β-谷甾醇明顯降低高血脂大鼠血清 TC、TG，抑制脂質過氧化，調節(jié)脂質代謝[27].黑猩猩實驗證實，β-谷甾醇降血脂優(yōu)于安妥明[28].漢黃芩素(M77)通過促進 AKT 的基因表達與蛋白活化，促進 GLUT4 的基因與蛋白表達，降低空腹血糖.此外，漢黃芩素可直接促進胰島素分泌[29].漢黃芩素可明顯降低總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)，這一作用可能與調節(jié)脂酶活性和影響脂質合成與氧化基因相關[30].益母草堿(M135)通過降低空腹血糖水平，在一定程度上改善葡萄糖耐量和提高db/db小鼠的血漿胰島素濃度，降低血漿甘油三酯的濃度，同時升高HDL的濃度來預防II型糖尿病的發(fā)生[31-32].在胰島素缺乏癥的情況下，大豆異黃酮(M78)能促進葡萄糖攝取、Ampk磷酸化和GLUT 4易位，還可抑制db/db和KK-Ay小鼠血糖水平的升高[33].

炎癥是胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病代謝紊亂的基礎，Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟呈現(xiàn)炎癥狀態(tài)，炎癥通路NF-κB被激活，并促進炎癥因子表達增多，異鼠李素(M114)抑制NF-κB p65和炎性細胞因子的產生，并且對NF-κB信號通路具有負調控作用，抑制NF-κB介導的炎癥反應，從而有利于腎損害的恢復[34].山奈酚(M123)可調節(jié)肝臟炎癥，提高胰島素敏感性，其機制與抑制糖尿病大鼠肝臟NF-κB信號有關[35].大量文獻報道炎癥因子TNF-a、IL-6等可干擾胰島素信號通路，包括干擾胰島素受體和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，結果失去對葡萄糖代謝酶包括GK、G6Pase及PEPCK的調控，導致肝臟葡萄糖輸出增加，最終促進高血糖的形成.益母草堿 (M135)抑制NF-κB炎癥通路，進一步抑制炎癥介質的表達，有恢復胰島素(P01308)信號的作用，使葡萄糖代謝酶正常表達而起到降低血糖作用[32].3-Butylidene phthalide(M16)、阿魏酸可協(xié)同抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎性因子NO、前炎因子IL-1β、TNF-a的釋放及iNOS、COX-2基因及蛋白的表達發(fā)揮抗炎作用[36].

GLUT 4易位和表達水平與胰島素介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關，適度增加GLUT 4的表達是治療Ⅱ型糖尿病IR的良好方法，豆甾醇(M47)有助于促進GLUT 4在細胞中的表達，糾正胰島素介導的GLUT 4易位缺陷，從而減輕KK-Ay小鼠的IR[37].芹菜素(M87)能明顯改善Ⅱ型糖尿病大鼠的糖脂代謝受損和胰島素抵抗，減輕糖尿病大鼠的血管病變，改善血管內皮功能，其機制是誘導胰島素的產生，抑制NO生成和NF-κB介導的內皮細胞炎癥反應[38].

Ⅱ型糖尿病中存在胰島β細胞凋亡，糖尿病患者體內β細胞凋亡頻率明顯增高，凋亡速度會增加 3～10倍，但增生、復制功能正常[39].糖皮質激素能上調細胞凋亡因子Bax表達，誘導胰島β細胞凋亡，益母草堿(M135)激活糖皮質激素受體(P04150)與糖皮質激素結合，可減少糖皮質激素的量進而保護胰島β細胞[40].發(fā)現(xiàn)水蘇堿(M124)通過調節(jié)SIRT 1的表達和活性，抑制高糖對內皮細胞的細胞毒作用[41]，減少藥對毒副作用的發(fā)生.

圖2D-T-J網(wǎng)絡分析結果表明，氨基-二肽酰肽酶IV(P27487)、β-1腎上腺素能受體(P08588)、凋亡因子Bcl-2(P10415)及單胺氧化酶MAO-A(P21397)和MAO-B(P27338)在藥對治療Ⅱ型糖尿病中發(fā)揮主要作用.凋亡因子Bcl-2(P10415)由239個氨基酸及3個外顯子和2個內含子組成，它能對抗各種凋亡的刺激而對細胞有保護作用，Bcl-2通過阻斷凋亡的最后通路而抑制凋亡[39]，或通過參與信號傳遞而抑制細胞凋亡[42].氨基-二肽酰肽酶IV(P27487)(DPP-IV)升高胰升糖素樣多肽1(GLP-1)的活性水平，GLP-1有刺激胰島素基因表達、增強β細胞的功能，抑制胰升糖素的分泌，提高飽食感，抑制攝食和延緩胃排空,這些均有助于血糖恢復正常[43].β-1腎上腺素能受體(P08588)是調節(jié)心臟功能及血壓的主要受體，與高血壓等密切相關，如血壓水平較高時，β-1腎上腺素能受體水平也很高;β-1腎上腺素能受體水平降低時，血壓隨之降低[44].單胺氧化酶(monoamine oxidase )為催化單胺氧化脫氨反應的酶，縮寫MAO，也稱為含黃素胺氧化酶，可分為MAO-A(P21397)和MAO-B(P27338)兩種亞型.據(jù)報道,糖尿病患者的單胺氧化酶活性升高，高血壓病人血小板內MAO活性升高[45].我們研究發(fā)現(xiàn)該藥對活性成分和上述靶點存在一定的聯(lián)系，M32、M77、M73、M87、M123、M132能作用于細胞凋亡因子Bcl-2，可能減少胰島β細胞凋亡.M76、M77、M83、M87、M114、M117、M123、M132能與氨基-二肽酰肽酶作用，可能與激活DPP-IV，保護胰島功能，調節(jié)Ⅱ型糖尿病患者的血糖值有關.M9、M13、M16、M47、M51、M59、M85、M117、M119、M129、M133可能抑制β-1腎上腺素能受體的活性，使糖尿病患者血壓降低.M9、M16、M34、M35、M47、M48、M72、M85、M95、M97、M117、M119、M133可以和MAO-A(P21397)作用，上述化合物可能抑制MAO活性，較好地發(fā)揮治療作用.這些可成為治療Ⅱ型糖尿病的新靶標、新機制，為新藥開發(fā)提供依據(jù).

綜上所述，“當歸-益母草”藥對治療Ⅱ型糖尿病是分子間的協(xié)同作用，通過干涉分子網(wǎng)絡、生物過程和途徑使機體恢復平衡，具有多成分、多靶點的特點.“當歸-益母草”藥對治療糖尿病主要是活血化淤，抗炎，調節(jié)機體血糖、血壓和胰島素平衡，改善微循環(huán)等，與目前抗Ⅱ型糖尿病的作用機制相符合.

4 結 論

我們利用網(wǎng)絡藥理學分析手段，篩選“當歸-益母草”藥對的活性成分，并預測其可能的直接作用靶點.進一步構建了D-T-D網(wǎng)絡及分析，確定了“當歸-益母草”藥對Ⅱ型糖尿病的物質基礎及關鍵調控靶點，并采用現(xiàn)有文獻挖掘方法為藥對治療Ⅱ型糖尿病的分子機制提供理論依據(jù).我們的研究對以“當歸-益母草”藥對為基礎方的復方，如補血益母顆粒、八珍益母丸、四物益母丸等進行深度挖掘、開發(fā)有重要意義.此外，我們將進一步研究 “當歸-益母草”藥對治療婦科疾病的網(wǎng)絡機制，并采用分子生物學、代謝組學等經(jīng)典方法，揭示“當歸-益母草”藥對治療婦科疾病的物質基礎及機理.