鄭青云，程俊，崔春霞，朱益波

(常熟理工學院，江蘇 常熟，215500)

3-苯基乳酸是一種重要的前體化合物，廣泛用于醫(yī)藥、化工、生物合成等領域[1]。D-3-苯基乳酸(D-3-phenyl lactic acid，PLA)是3-苯基乳酸的一種光學異構體。近年來，研究人員在一些天然蜂蜜、干酪、發(fā)酵面團及乳酸菌、白地霉的發(fā)酵產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)該化合物的存在，并證明該化合物起到了抑制產(chǎn)品霉變、腐敗，延長產(chǎn)品貨架期的作用[2-7]。PLA對于常見致病菌以及真菌具有廣譜而高效的抑菌活性[2-3]，使其有望成為一種更為安全、高效的天然抑菌劑。由于化學法合成的3-苯基乳酸為外消旋混合物，需要復雜的拆分過程以獲得高光學純度產(chǎn)物[8-9]。因此，近年來，包括本研究室在內的眾多研究者在PLA的高光學純度生物合成與轉化方面進行了廣泛而深入的研究[6, 10-33]。目前利用重組大腸桿菌合成PLA的生產(chǎn)強度已經(jīng)達到10 g/(L·h)以上，光學純度接近100%[31]。然而，PLA的提取純化方法目前依然主要是采用乙酸乙酯萃取法[34]。該方法需用酸將料液pH值調節(jié)至2，再加入萃取劑進行萃取，有機相再經(jīng)減壓蒸餾獲得產(chǎn)品。該方法比較適用于化學合成法，對于利用微生物細胞轉化工藝獲得的產(chǎn)品，因其成分相對復雜，使用簡單的萃取法已不能滿足純化的要求，因此開發(fā)適用于提取發(fā)酵液中的PLA工藝顯得尤為重要。

本研究使用離子交換法從發(fā)酵液中直接分離PLA,通過對常用陰離子交換樹脂的篩選，優(yōu)化了上樣和洗脫條件，建立了適用于重組大腸桿菌合成產(chǎn)物的離子交換樹脂分離純化PLA工藝，為用離子交換樹脂純化PLA及類似物提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑和菌株

D-3-苯基乳酸(PLA)和苯丙酮酸(PPA)購自國藥集團化學試劑有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨等購自Oxoid；異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素購自上海生工生物工程有限公司；離子交換樹脂：201×7、D101、D285、D301、D315、D318購自艾美科健(中國)生物醫(yī)藥有限公司。

1.1.2 菌株

菌株：E.colipET-28a-ldhY52V，實驗室保藏[30]。

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜儀LC-20A,日本島津公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器,太倉市華美生化儀器廠；BSZ-160F電腦自動部分收集器,上海精科實驗有限公司；HL-2恒流泵,上海佳鵬科技有限公司；超純水機,蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組大腸桿菌合成PLA

參考ZHU[30]的方法，將重組大腸桿菌E.colipET-28a-ldhY52V接種于LB培養(yǎng)基中(含50 mg/L 硫酸卡納霉素)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6時添加IPTG至0.6 mmoL/L，25 ℃誘導4 h。將菌體于4 ℃，6 000 r/min離心10 min。菌泥用pH=7.0的磷酸緩沖溶液洗滌2次。收集的菌泥重懸于50 mL含7.5 g/L苯丙酮酸，10 g/L 葡萄糖的pH=7.0的磷酸緩沖溶液中，37 ℃，200 r/min轉化1 h。發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min收集上清液待用。

1.2.2 樹脂的預處理及選型

樹脂的預處理：用體積分數(shù)5%的HCl浸泡24 h，再用蒸餾水洗至中性，然后用體積分數(shù)5% NaOH浸泡24 h，再用蒸餾水洗至中性。

樹脂的選型：采用靜態(tài)試驗篩選出吸附能力較強的樹脂。靜態(tài)試驗：準確稱取已處理好的樹脂1 g，分別放入盛有20 mL，20 g/L PLA的錐形瓶中，在恒溫振蕩器中，以30 ℃、200 r/min的條件振蕩交換24 h，定時取樣測定PLA質量濃度，以減差法計算樹脂的平衡吸附量[35]。

1.2.3 固定床上樣條件優(yōu)化

玻璃層析柱，樹脂體積裝填量為4 mL。選用不同上樣流量(4、7、10、13 BV/h)和徑高比(1∶5、1∶7、1∶10、1∶15)將發(fā)酵液分別上樣。自動部分收集器收集流出液，每管收集2 mL流出液，測定其PLA質量濃度。

1.2.4 洗脫條件優(yōu)化

發(fā)酵液進行上樣后用1倍柱床體積超純水洗去柱中殘留的發(fā)酵液。然后用不同濃度NaCl和HCl溶液進行洗脫，洗脫劑流速為5 BV/h, 分別收集流出液，測定PLA和PPA質量濃度。

1.2.5 定量分析

取樣品適當稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后由高效液相檢測。色譜條件根據(jù)文獻設定[30]：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H有機酸分析柱；流動相為5 mmol/L稀H2SO4；流速為0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積5 μL；紫外檢測器檢測波長210 nm，葡萄糖采用串聯(lián)示差折光檢測器檢測。

2 結果與討論

2.1 重組大腸桿菌合成PLA過程

采用E.colipET-28a-ldhY52V轉化PPA合成PLA的過程如圖1所示。分批轉化過程表明底物PPA在前30 min迅速轉化為產(chǎn)物PLA，之后隨著底物濃度的下降，產(chǎn)物PLA合成速率也隨之降低，經(jīng)過60 min的轉化，最終PLA質量濃度為5.1 g/L，發(fā)酵液中殘留底物質量濃度為1.2 g/L，產(chǎn)物對底物的得率為68%。整個轉化過程葡萄糖消耗速率基本保持穩(wěn)定，說明在轉化過程中細胞活力維持在比較穩(wěn)定的狀態(tài)。盡管隨著時間的延長，殘留的PPA可能會進一步轉化為PLA，為了保證轉化的時間空間效率，本實驗轉化時間設定為60 min。

圖1 E. coli pET-28a-ldhY52V合成PLA過程曲線Fig.1 The curve of PLA synthesis by E. coli pET-28a-ldhY52V

2.2 樹脂的選型

通過靜態(tài)吸附實驗，得到各樹脂對于PLA和PPA的靜態(tài)吸附容量，如表1所示。其中弱堿大孔型樹脂D315和D318對PLA具有較大的交換容量，其中D315的交換容量為216.2 mg/g。不同樹脂對于PPA的吸附能力有所差異，其趨勢與對PLA的吸附能力相似。因此選擇D315作為本實驗的離子交換填料。

表1 不同樹脂交換容量的比較Table 1 Comparison of the exchange capacity by different resin

2.3 固定床上樣條件優(yōu)化

2.3.1 流量對流出曲線的影響

不同流量對流出曲線的影響如圖2所示，隨著上樣流量的增加，穿透點出現(xiàn)時間縮短。這可能是由于上樣流量提高導致固液接觸時間變短，PLA不能與樹脂充分發(fā)生交換反應使得穿透點提前出現(xiàn)。該結果表明過高的上樣流速會使樹脂未飽和吸附，顯著降低樹脂的利用率。實驗范圍內選擇4 BV/h的流量上樣較為合理。但是根據(jù)實際的操作情況，低流量上樣耗時多，在上樣開始階段可以選擇高流量，之后以低流量上樣至穿透以提高柱子利用率和生產(chǎn)效率。

圖2 上樣流量對流出曲線的影響Fig.2 Effect of space velocity on the effluent curve注：C為流出液中PLA的質量濃度，C0為上樣前PLA的初始質量濃度，下同。

2.3.2 徑高比對流出曲線的影響

徑高比對流出曲線的影響如圖3所示，當徑高比為1∶7、1∶10和1∶15時，相對徑高比1∶5交換區(qū)域明顯拉長，交換時間增加，穿透點顯著延后，拖尾現(xiàn)象明顯。另外，過低的徑高比容易導致裝填不均勻，局部交換過程受到影響，較高的徑高比流出曲線容易穿透，因此從試驗結果看選擇徑高比為1∶7進行裝填。

圖3 徑高比對流出曲線的影響Fig.3 Effect of resin height on the effluent curve

2.4 洗脫條件優(yōu)化

2.4.1 混合洗脫劑一步洗脫

NaCl和HCl溶液是離子交換常用的洗脫劑。首先采用不同濃度的NaCl混合洗脫劑(NaCl和HCl)對樹脂進行洗脫(如圖4)。采用10 mmol/L的HCl和NaCl混合洗脫劑進行洗脫，洗脫液中只含有微量的PPA和PLA，隨著混合洗脫液中NaCl濃度的升高，PLA和PPA洗脫下來的質量濃度逐漸升高。說明離子強度的提高增強了混合洗脫液的洗脫能力。但是在這些條件下PLA和PPA同時被洗脫下來，完全沒有達到分離的效果。這一結果說明采用混合洗脫劑不能將發(fā)酵液中的產(chǎn)物PLA和底物PPA很好地分離。

a-10 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫; b-50 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫; c-100 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫圖4 NaCl濃度對洗脫曲線的影響Fig.4 Effect of different concentration of NaCl for the elution curve

考慮到pH值會影響PLA和PPA的帶電狀態(tài)，進而改變與離子交換樹脂的作用力。調節(jié)洗脫劑的pH值可能有助于改善洗脫劑的選擇性，因此通過改變HCl濃度分析其對PLA和PPA的分離效果。為保證一定的洗脫強度和防止過高的NaCl濃度造成PLA和PPA的大量洗脫影響洗脫劑的選擇性，將NaCl濃度設為50 mmol/L。實驗結果如圖5所示。隨著HCl濃度升高，流出液中PLA和PPA的質量濃度有所升高，低pH值使得兩種物質的在洗脫的同時分離效果更加明顯。實驗結果表明調節(jié)洗脫劑HCl濃度有助于提高洗脫劑對PLA和PPA的分離度。

a-50 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫；b-50 mmol/L NaCl和50 mmol/L HCl洗脫;c-50 mmol/L NaCl和100 mmol/L HCl洗脫圖5 不同HCl洗脫濃度對洗脫曲線的影響Fig.5 Effect of different concentrations of HCl for the elution curve

2.4.2 兩階段洗脫

提高NaCl濃度可以加強洗脫強度，提高洗脫劑HCl濃度可以改善洗脫選擇性。為進一步改善分離效果和洗脫效率，考查采用兩階段分步洗脫的效果。第一階段采用HCl單獨洗脫；第二階段由NaCl單獨洗脫。第一階段洗脫結果如圖6所示。采用100 mmol/L HCl單獨洗脫時流出液中PLA迅速洗出，在洗脫體積約60 mL時，流出液中PLA濃度達到高峰，隨后逐漸下降至較低水平。在這一過程中，盡管有微量的PPA洗脫出來，但是PLA與PPA總體獲得了較好地分離。用200 mmol/L HCl單獨洗脫時，PLA同樣被迅速洗脫，最高峰出現(xiàn)在不到50 mL洗脫體積處，因此顯得峰高而窄。盡管如此，由于提高了HCl濃度的同時也提高了洗脫劑中Cl-濃度，從而提高了對PPA的洗脫強度，導致較多量的PPA也一同被洗脫出來，這并不利于兩者的分離。因此，由圖5可知HCl濃度為100 mmol/L時分離效果較佳，因此第一階段洗脫劑選擇100 mmol/L HCl。

a-100 mmol/L HCl洗脫；b-200 mmol/L HCl洗脫圖6 不同濃度HCl對第一階段洗脫曲線的影響Fig.6 Effect of different concentrations of HCl for the first phase elution curve

第一階段用HCl單獨洗脫時，可比較有效地洗脫PLA，但樹脂中還殘留著一定量的PPA。為提高樹脂洗脫效率和樹脂的使用壽命，第二階段利用較高濃度的200 mmol/L NaCl進行洗脫。結合第一階段的結果，確定第二階段洗脫從洗脫體積到150 mL開始進行。完整的兩階段洗脫曲線如圖7所示。在第一階段洗脫液中，PPA的含量較低，PLA的純化效果較好。

圖7 階段洗脫曲線Fig.7 Stepwise elution curve

2.5 PLA離子交換分離純化效果分析

用發(fā)酵液上樣，上樣體積記為V0，收集上樣流出液和洗柱液,其體積記為V1，第一階段洗脫液體積為V2，第二階段洗脫液體積為V3，測定其中PLA和PPA的質量濃度,結果如表2所示。第一階段HCl洗脫，收集液中PLA質量濃度為110.6 mg/L，相應PPA的質量濃度為 10.7 mg/L，由初始發(fā)酵液PLA與PPA的質量濃度比4.2提高至10.3，表明該方法有效地將PLA和PPA進行了分離，達到了初步純化的目的。第二階段的NaCl洗脫液中PPA質量濃度較高，有助于將殘留在樹脂中的底物洗脫。驗證結果表明二階段分步洗脫可以改善對PLA洗脫的選擇性，有效地將發(fā)酵液中PLA與PPA進行分離。

表2 分離純化效果分析Table 2 Consequence of purification

注：“-”代表PLA回收率不計。

3 結論

利用重組大腸桿菌E.colipET-28a-ldhY52V轉化PPA合成了PLA，通過樹脂的預處理，利用靜態(tài)吸附法篩選了吸附量最大的大孔弱堿陰離子交換樹脂D315用于分離PLA。在上樣量為1.25倍柱床體積條件下優(yōu)化結果表明，上樣流量為4 BV/h，徑高比為1∶7的裝填高度時上樣吸附效果較好。洗脫工藝采用階段洗脫效果較好：第一階段用100 mmol/L HCl作為洗脫劑，在流速為5 BV/h下洗脫約37個柱床體積，該階段PLA回收率為66.4%；第二階段采用200 mmol/L NaCl在同樣流速下洗脫約17個柱床體積。該洗脫工藝第一階段的洗脫液中PLA/PPA的質量濃度比值由初始的4.2上升為10.3，取得一定的純化效果，第二階段有利于樹脂的清洗和再生，提高分離柱的分離效率。但是，在該條件下的分離效果和PLA回收率依然較低，本研究為進一步改善離子交換法分離純化發(fā)酵液中PLA的工藝研究提供了初步借鑒。