劉軍，江若宇，王麒麟，帖余，王鑫，李麗

(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢,643000)

四川曬醋是屬于我國“四大名醋”[1]之一的四川麩醋，它以麩皮、大米為主要原料，沿用歷史傳統(tǒng)秘方的釀制技藝，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、日曬(其醋坯和成品醋均經(jīng)日光暴曬)、陳釀四大工藝流程，20多道工序制成，故簡稱“曬醋”，其產(chǎn)品色澤黑褐、無沉淀、香氣芬芳，具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長、久存不腐的特點(diǎn)[2]。四川曬醋以麩皮為主要釀制原料，固態(tài)開放式多菌種混合接種，輔以獨(dú)特的藥曲配方，采用糖化、酒化、醋化同池進(jìn)行發(fā)酵，形成獨(dú)特微生物群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)。

王祝健[3]等發(fā)現(xiàn)，在陜西醋醅中存在著大量的芽孢桿菌，分離出的大部分芽孢桿菌都具有產(chǎn)酸的能力，且對成品醋的口感及香氣有重要的影響。許偉[4]等從鎮(zhèn)江香醋醋醅分離得到4株芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)，都具有產(chǎn)有機(jī)酸和產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的能力。因此，發(fā)酵過程中對芽孢桿菌的控制程度會影響食醋品質(zhì)。

由于釀造原料中含有大量的纖維素，而纖維素是一種由葡萄糖組成的很難降解的多糖，它的存在會導(dǎo)致原料利用率低下，因此，本試驗(yàn)的目的是找到1株能降解纖維素的微生物，從而提高原料利用率。

本文從曬醋醋醅中分離得到多株芽孢桿菌，以產(chǎn)纖維素酶為主要指標(biāo)，以產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶為輔助指標(biāo)進(jìn)行比對，得到幾株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的芽孢桿菌，并對其進(jìn)行分類學(xué)鑒定，為四川曬醋的醋酸發(fā)酵優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

試驗(yàn)菌種：從四川某曬醋廠醋醅中分離得到。

試劑：蛋白胨、可溶性淀粉、酵母膏、牛肉膏、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、NaCl、干酪素、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、(NH4)2SO4、瓊脂、胰蛋白胨、溴甲酚紫、3,5-二硝基水楊酸等，均為分析純，購于成都科龍化工試劑公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：蛋白胨1%，可溶性淀粉0.3%，酵母膏0.3%，KH2PO40.15%，K2HPO40.2%，MgSO40.1%，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

完全培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂15%～20%，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

選擇培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：羧甲基纖維素鈉1%，NaCl 0.125%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.4%，MgSO40.05%，瓊脂20%，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：羧甲基纖維素鈉1%，NaCl 0.125%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.4%，MgSO40.05%，121 ℃滅菌20 min。

酪蛋白培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：干酪素0.5%，葡萄糖0.1%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，K2HPO40.05%，MgSO40.01%，瓊脂15%，pH值7.2，115 ℃滅菌30 min。

淀粉酶培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：可溶性淀粉0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.5%，瓊脂15%，pH值7.2，115 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min，121 ℃滅菌20 min。

穿刺培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.05%，NaCl 0.05%，瓊脂0.08%，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酸產(chǎn)氣發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)：酵母膏0.1%，葡萄糖0.1%，溴甲酚紫0.4%，115 ℃滅菌30 min。

葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)：K2HPO40.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.5%，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DM500正置生物顯微鏡,德國萊卡；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺,蘇州凈化；G154DS立式自動壓力蒸汽滅菌器,致微儀器有限公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱,北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KD-LS空氣搖床,廣州番禺旭東阪田電子有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司；300V400MA75W 電泳儀,北京洪濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋,上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；CP214電子天平,奧豪斯儀器有限公司；S1000 PCR儀,上海菲特科學(xué)器材有限公司；PiCo21 臺式高速離心機(jī),北京線上生物科技有限公司；SC805凝膠成像系統(tǒng),成都一科儀器設(shè)備有限公司；DHG-9070A立式鼓風(fēng)干燥箱,上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

取四川省某曬醋廠醋醅發(fā)酵4、8、12、16、20 d的醋醅。

1.2.2 芽孢桿菌的分離純化和保存

取1 g醋醅于 100 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩后，取4 mL接種于100 mL的無菌富集培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min下，培養(yǎng)48 h。將富集培養(yǎng)基在90 ℃水浴熱加熱10 min，得到芽孢的富集液。取1 mL芽孢富集液進(jìn)行10倍濃度稀釋后，取適當(dāng)質(zhì)量濃度的菌懸液涂布到完全培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，然后觀察并記錄各平板中菌落形態(tài)以及培養(yǎng)基上透明圈的大小等形態(tài)。

從不同平板上挑取長勢良好、透明圈較大的典型單菌落進(jìn)一步純化，直到確認(rèn)是形態(tài)一致的單菌落后，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)胞形態(tài)，判斷是否進(jìn)一步純化。之后將單菌落于斜面培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后，保存于4 ℃冰箱待用。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌的分離純化和保存

稱取10 g醋醅置于帶有玻璃珠的200 mL 無菌生理鹽水中，搖床振蕩30～60 min，取10 mL菌液加入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，37 ℃、 150 r/min培養(yǎng)24 h，取富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋、涂布于選擇培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 48 h，挑取單菌落點(diǎn)接選擇性培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，倒入1 mg/mL剛果紅溶液染色10 min，倒去剛果紅溶液，向平板加入1 mol/L 的NaCl 溶液浸泡15 min 脫色，觀察菌落周圍有無水解圈，并測量菌圈比，并且將產(chǎn)纖維素酶活力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行保藏[5-6]。

1.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

將菌株進(jìn)行平板劃線，在選擇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng) 48 h后，對菌株的單菌落進(jìn)行觀察，并參照《伯杰氏細(xì)菌手冊》[7]相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行檢測。

1.2.5 菌株16S rDNA的分子生物學(xué)鑒定

將培養(yǎng)12 h的菌液1.5 mL，12 000 r/min離心1 min得菌體，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒法提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA。以菌株的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：模板5.0 μL，正反向引物各0.5 μL，10×buffer 5.0 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性： 94 ℃， 4 min；變性： 94 ℃， 1 min；退火： 55 ℃， 1 min；延伸： 72 ℃，1 min；循環(huán)數(shù)： 20；終延伸： 72 ℃， 10 min。

1.2.6 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株序列再GenBank 數(shù)據(jù)庫終進(jìn)行BLAST同源性對比分析，運(yùn)用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定所選菌株的種屬。

1.2.7 纖維素粗酶液的提取

按體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、 150 r/min 培養(yǎng)48 h，吸取菌液2 mL 于 EP 管中， 4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液即為纖維素酶粗酶液。

1.2.8 酶活的測定

通過DNS比色法測定還原糖的量來測定纖維素粗酶液的酶活[8],按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：M，吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出的葡萄糖質(zhì)量，mg;P，為反應(yīng)體系體積，mL;N，稀釋倍數(shù)；T，反應(yīng)時(shí)間，min；V，參加反應(yīng)酶液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin 8.5等軟件作圖，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[9]；菌株系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 6.0軟件進(jìn)行建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的初篩

本研究從四川曬醋醋醅中篩選出了14株芽孢桿菌菌株，編號為YB1.1～YB9.1，YB1.2～YB9.2。

2.2 菌株形態(tài)學(xué)特性

從菌落形態(tài)觀察中可知，從四川曬醋醋醅中分離得到的芽孢桿菌菌落主要分為乳白和微黃色，圓形居多，表面濕潤，菌落較大，邊緣不整齊。革蘭氏染色為紫色，其細(xì)胞形態(tài)為鏈狀。如圖1所示。

圖1 芽孢桿菌形態(tài)特性Fig.1 Strains physiological form

2.3 菌株生理生化特征

將分離出的菌株在平板上進(jìn)行劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h后，參照《伯杰氏細(xì)菌手冊》對菌株進(jìn)行了部分生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示：菌株甲基紅、V-P、產(chǎn)酸、穿刺、接觸酶試驗(yàn)均為陽性，芽孢是否膨脹、產(chǎn)氣為陰性。

2.4 產(chǎn)酶試驗(yàn)

通過產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶試驗(yàn)，比較菌株的產(chǎn)酶能力的大小，結(jié)果見表2所示。

由表2可看出，產(chǎn)3種酶能力較強(qiáng)的菌株有YB5.1、YB3.2、YB8.2、YB9.2。其中YB5.1產(chǎn)3種酶能力均強(qiáng)于其他菌株。

2.5 菌株的16S rDNA的分子鑒定

根據(jù)透明圈大小和產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定YB5.1為目的菌株，因而對YB5.1進(jìn)行研究。以菌株YB5.1的基因組為模板，PCR擴(kuò)增出16S rDNA 序列后送生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，大小約為1 600 bp，電泳檢測結(jié)果如圖 2、圖3所示。

表1 菌株部分生理生化特征Table 1 Partly biochemical and physiological characteristics of the strain YB5.1

注：+表示陽性，-表示陰性。

表2 產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)Table 2 Enzyme production experiment

注： “+”是菌株產(chǎn)生的透明圈，透明圈越大，“+”越多?！?”代表沒有透明圈產(chǎn)生。

A、B-菌株YB5.1基因組提取產(chǎn)物；C-模板基因圖2 DNA電泳圖Fig.2 DNA electrophoresis

D、E-菌株YB5.1基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；F-模板基因圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoresis of PCR products

圖2表明基因組DNA提取成功。

由圖3可知，產(chǎn)物的bp數(shù)大概在1 600左右，表示16S rDNA擴(kuò)增成功。

將測序所得到的序列利用 DNAMAN 6.0 完成拼接，利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn) YB5.1 16S rDNA與芽孢桿菌屬相似度最高。下載芽孢桿菌的典型菌種 16S rDNA序列，用Clustal進(jìn)行比對，用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4) ，獲得目的菌株的分類地位和它的系統(tǒng)發(fā)育地位，結(jié)果表明 YB5.1 16S rDNA 與Bacilluscereus(KC248212.1) 同源關(guān)系最近，其可信度達(dá)到了99。再結(jié)合其生理生化特征分析可知分離菌株YB5.1鑒定為蘇云金芽胞桿菌屬(Bacillusthuringiensis)。

圖4 菌株YB5.1的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 N-J phylogenetic tree of strain YB5.1

2.6 菌株產(chǎn)纖維素酶活能力

根據(jù)測得的吸光度作圖，菌株產(chǎn)纖維素酶活能力見如圖5。經(jīng)過37 ℃，48 h培養(yǎng)后，菌株YB3.1、YB3.2、YB8.2的產(chǎn)纖維素酶活較高，分別達(dá)到了94.56，101.41和96.15 u/g；而YB5.1的纖維素酶活最高，達(dá)到161.33 u/g。此次篩選出的產(chǎn)纖維素酶活較高的芽孢桿菌YB5.1可為川南曬醋的發(fā)酵優(yōu)化提供基礎(chǔ)。

圖5 菌株產(chǎn)纖維素酶活能力Fig.5 Cellulase production capacity of strains

3 結(jié)論

本研究采用高溫處理，從四川曬醋醋醅中篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，并對其產(chǎn)酶特性進(jìn)行分析。通過平板劃線和平皿生化反應(yīng)法對四川曬醋醋醅中的芽孢桿菌進(jìn)行分離純化，篩選出1株產(chǎn)纖維素酶酶活較高的芽孢桿菌YB5.1，進(jìn)而通過16S rDNA的同源序列分析對該菌株進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定，確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌屬(Bacillussugenbacillus)。該菌株在產(chǎn)纖維素酶，產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶能力上均優(yōu)于其他菌株，其產(chǎn)纖維素酶活達(dá)到了161.33 u/g。