張宇，王連艷，王艷萍

1(天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津，300450) 2(中國科學院 過程工程研究所，北京，100089)

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，LA)為乳桿菌屬，是革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于人體和一些動物腸道內(nèi)，為益生菌[1-3]。很多益生菌口服經(jīng)過胃的強酸環(huán)境時容易失活，導致其在腸道發(fā)揮的活性作用較弱，為了最大限度保證益生菌在腸道中的活性，發(fā)揮腸道菌群調節(jié)作用的有益功效，將益生菌微膠囊化可以起到很好的隔離保護作用，使其到達腸道時發(fā)揮更好的功效。

海藻酸鈉是海藻中提取出來的β-D-甘露糖醛酸和 α-L-古羅糖醛酸組成，是線性雜多糖[4]，具有良好的生物相容特性和生物可降解特性，海藻酸鈉可在某些二價陽離子如Ca2+、Ba2+存在時吸收水分生成凝膠[5-13]，可用于微膠囊的制備。另外，海藻酸鹽微膠囊具有優(yōu)良的pH敏感釋放的特性，在酸性環(huán)境下表面更為致密，保護所包埋的益生菌，而在腸道的pH環(huán)境下，能夠迅速崩解，釋放出包埋的益生菌，發(fā)揮調節(jié)腸道菌群的作用?，F(xiàn)有的海藻酸鹽微膠囊的制備方法包括微乳化法、噴霧干燥法、擠壓法及復合凝聚法。其中，噴霧干燥法應用最廣泛，具有操作簡單，成本較低的優(yōu)點。噴霧干燥法是利用高壓泵，將物料通過霧化器以一定速度的氣流剪切成小液滴，與較高溫度的熱空氣接觸使水分迅速氣化得到干燥的產(chǎn)品。此方法中，干燥時，液滴要與高溫氣體接觸，這會導致所包埋的活性物質失活。為了保持所包埋物質的活性，在噴霧干燥法的基礎上，我們發(fā)展了噴霧法結合離子固化法，以嗜酸乳桿菌為模式益生菌，制備微膠囊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)來自于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，由天津科技大學發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室提供。

海藻酸鈉, 比利時Acros Organics公司；無水氯化鈣、無水乙酸鈉、乙酸, 西隴科學股份有限公司；生理鹽水，石家莊四藥有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

B-290小型噴霧干燥儀，瑞士BUCHI Labortechnik公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；超聲波清洗機，寧波新芝生物科技公司；XSZ-H3光學顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；WV-CP230/G攝像頭，日本Panasonic公司；Coulter Ls230激光粒度儀，美國Coulter 公司；JEM-6700F掃描電鏡，日本JEOL公司的產(chǎn)品；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；BS 110S型天平-，德國Sartorius公司；高速離心機，美國Beckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基的配置

培養(yǎng)基配制：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、 K2HPO42.0 g、醋酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g、MnSO4·4 H2O為0.25 g、蒸餾水1 000 mL，將上述物質溶解后，調整培養(yǎng)基的pH值為6.2～6.6(滅菌后為6.0～6.5)，121 ℃下滅菌20 min[26]，備用。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)與方法

使用平板劃線法將保存于-80 ℃冰箱中的嗜酸乳桿菌接種于MRS平板上，通過平板劃線法，得到嗜酸乳桿菌單菌落。隨后，將嗜酸乳桿菌單菌落接種于5 mL的液體MRS培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃的恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待菌體布滿試管底部時，接著繼續(xù)傳代1次，將連續(xù)活化2次的菌體保存于4 ℃冰箱中，備用[2]。

1.2.3 空白海藻酸鈣微膠囊制備優(yōu)化

采用噴霧法結合離子固化法制備載嗜酸乳桿菌微膠囊，為了獲得最佳嗜酸乳桿菌包埋效果，首先進行了空白海藻酸鈣微膠囊制備工藝優(yōu)化。具體制備過程如下：

將適量海藻酸鈉粉末溶解于生理鹽水中，制成海藻酸鈉溶液，由噴霧干燥器的蠕動泵將其帶入設備中，由一定氣速的氣體將海藻酸鈉溶液切成小液滴，通過噴嘴噴入質量分數(shù)為1%的CaCl2水溶液，在300 r/min的攪拌速度下對噴入的液滴固化，隨后，離心洗滌去除多余的CaCl2和沒有固化的液滴，最后將海藻酸鈣微膠囊懸浮于生理鹽水中，備用[14]。

海藻酸鈣微膠囊的粒徑對益生菌包埋和后續(xù)體內(nèi)評價緊密相關。通常而言，益生菌大多為微米級，采用微膠囊進行包埋時，若微膠囊粒徑太小，益生菌的包埋率會比較低；若微膠囊粒徑太大，在后續(xù)進行動物體內(nèi)評價時，不利于進行給藥研究，通常采用小鼠進行口服給藥后，進行腸道微生態(tài)調節(jié)等評價，在進行小鼠灌胃給藥時，微膠囊粒徑不能太大，通常需要控制在50 μm以下[27-29]。為了獲得合適粒徑的海藻酸鈣微膠囊，需要進行空白微膠囊制備工藝優(yōu)化。采用噴霧結合離子固化法制備海藻酸鈣微膠囊時，海藻酸鈉質量分數(shù)、氣速和進料速度是調節(jié)微膠囊粒徑大小的主要因素。在獲得最優(yōu)海藻酸鈣微膠囊制備工藝后，再制備載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊。

制備海藻酸鈣微膠囊時，海藻酸鈉質量分數(shù)通常控制在1%～1.5%；氣速越高，微膠囊粒徑越??；進料速度越大，微膠囊粒徑越大[14]。

綜合考慮，設計了L9(34)的正交試驗，以海藻酸鈉質量分數(shù)、氣速及進料速度進行3因素3水平的正交試驗，實驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level of factor used in orthogonal array design

1.2.4 微膠囊粒徑及粒徑分布測定

微囊的粒徑大小及粒徑分布采用激光粒度儀進行測定。取一定量的微膠囊重懸于生理鹽水中，超聲分散后，將其滴加到激光粒度儀的樣品池中，進行體積平均粒徑(d4,3)及粒徑分布(Span)的測定。

(1)

式中：di，每個粒子的直徑；ni，直徑是di的粒子數(shù)。

Span=(d90-d10)/d50

(2)

式中：d90、d50、d10分別表示微膠囊樣品中90%、50%、10%的顆粒直徑小于該值所示尺寸。

1.2.5 微膠囊形態(tài)觀察

采用具有拍攝功能的光學顯微鏡對微膠囊的形態(tài)進行觀察、拍照及記錄，具體過程如下：使用滴管滴加少量樣品于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，先在低倍鏡下找到合適的視野，再轉換到高倍鏡進行微膠囊形態(tài)觀察，同時用WV-CP230/G攝像頭將樣品狀態(tài)拍攝記錄，通過形態(tài)觀察初步評價微膠囊的質量。

1.2.6 載嗜酸乳桿菌微膠囊的制備

稱取一定量的海藻酸鈉粉末溶于生理鹽水中，制成海藻酸鈉溶液備用。將適量菌液與上述海藻酸鈉溶液混合，緩慢攪拌，混合均勻后，用噴霧干燥器的蠕動泵將含菌的海藻酸鈉懸浮液帶入設備中，在一定氣速作用下，將上述懸浮液切成小液滴，通過噴嘴噴入質量分數(shù)為1%的CaCl2水溶液中，在300 r/min的攪拌下固化液滴，隨后，離心洗滌除去多余的CaCl2和未固化的液滴，將收集的微膠囊懸浮在生理鹽水中，備用[14]。

1.2.7 嗜酸乳桿菌微膠囊活菌包埋率的測定

將嗜酸乳桿菌微膠囊置于無菌濃度為0.2 mol/L 的檸檬酸鈉溶液中，在 37 ℃ 、100 r/min攪拌條件下將微膠囊裂解30 min，微膠囊完全裂解后，離心收集菌體，重懸于生理鹽水中。用生理鹽水梯度稀釋菌液，分別吸取200 μL各梯度菌液涂布于MRS平板中，用無菌涂布器涂布均勻，各稀釋濃度做3個重復測定平板，并留下一個平板作空白對照。然后將平板倒置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況，計錄菌落數(shù)?；罹鷶?shù)按公式(3)計算，益生菌活菌包埋率按公式(4)計算：

(3)

(4)

式中：S，活菌數(shù)， CFU/mL；X1，平板1菌落數(shù)，個；X2，平板2菌落數(shù)，個；X3，平板3菌落數(shù)，個；E，包埋率，%；C1，微膠囊裂解后測得的活菌數(shù)，CFU/mL；C，總菌數(shù)，CFU/mL。

采用平板菌落計數(shù)法計算海藻酸鈣微膠囊中嗜酸乳桿菌的包埋率，其實也是對微膠囊中嗜酸乳桿菌活性的測定。

2 結果與分析

2.1 空白海藻酸鈣微膠囊制備優(yōu)化

2.1.1 正交試驗優(yōu)化結果

空白海藻酸鈣微膠囊優(yōu)化制備的正交試驗結果如表2所示。

表2 空白海藻酸鈣微膠囊正交試驗結果Table 2 The orthogonal design results of blank calcium alginate microcapsules

海藻酸鈉質量分數(shù)、氣速和進料速度這3個因素對空白微膠囊粒徑大小的影響程度為：氣速>進料速度>海藻酸鈉濃度?？瞻孜⒛z囊的最優(yōu)水平組合為A3B1C1，即海藻酸鈉質量分數(shù)為1.5%、氣速為450 L/h、進料速度為1 mL/min。

圖1顯示了海藻酸鈉質量分數(shù)、氣速及進料速度對所制備的海藻酸鈣微膠囊粒徑大小的影響。結果顯示，隨著氣速的增加，微膠囊粒徑隨之減?。浑S著進料速度的增加，微膠囊的粒徑也隨之增加；而海藻酸鈉質量分數(shù)對微膠囊粒徑大小影響不大。

圖1 海藻酸鈉質量分數(shù)(A)、氣速(B)及進料速度(C)對微膠囊粒徑大小的影響Fig.1 Effect of the concentration of sodium alginate(A), the spray gas flow(B) and the feed flow(C) on size of microcapsules

2.1.2 驗證性試驗

在上述優(yōu)化工藝下，制備了3批空白海藻酸鈣微膠囊，驗證優(yōu)化結果可靠性。

采用光學顯微鏡對制備的3批微膠囊形態(tài)進行了觀察，初步評價微膠囊產(chǎn)品質量。圖2為放大倍數(shù)100×下3批空白海藻酸鈣微膠囊的光學顯微鏡照片，結果顯示，制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊球形規(guī)整、分散性好，3批間差異不大。

圖2 最優(yōu)工藝下制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊的粒徑分布圖Fig.2 Size distributions of blank alginate microcapsules prepared by optimal parameters

所制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊的粒徑及粒徑分布結果如圖3所示，結果顯示，制備得3批空白海藻酸鈣微膠囊粒徑大小和粒徑分布相近，3批微膠囊的平均粒徑大小和Span值的偏差分別為1.640、1.729、1.938，表明正交試驗優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝真實可靠。

圖3 優(yōu)化條件下制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊的光學顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 Optical micrographs of blank calcium alginate microcapsules prepared by optimal parameters

2.2 載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊制備

分別采用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡對嗜酸乳桿菌的形貌進行觀察，結果如圖4所示。通過革蘭氏染色法對嗜酸乳桿菌進行鑒別，圖4-A結果顯示，包埋用的嗜酸乳桿菌為革蘭式陽性菌；采用掃描電子顯微鏡觀察了嗜酸乳桿菌的形貌，圖4-B為放大5 000倍下的嗜酸乳桿菌的形貌，結果顯示，嗜酸乳桿菌為桿狀菌，桿的末端呈圓形，長度約為2～3 μm，桿的截面直徑約為600 nm。

圖4 嗜酸乳桿菌的光學顯微鏡照片(A)和掃描電鏡照片(B)Fig.4 Optical graphs(A)and SEM graphs(B)of Lactobacillus acidophilus

2.2.1 嗜酸乳桿菌加入量對海藻酸鈣微膠囊制備的影響

在優(yōu)化條件下考察了不同菌加入量對載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊形貌、粒徑和菌包埋量的影響。在菌加入量分別為108、109、1010和1011CFU/mL的條件下進行了載嗜酸乳桿菌微膠囊的制備，制備得到的微膠囊的粒徑及粒徑分布和平均粒徑比較結果如圖5所示。

從圖5可以看出，隨著菌液含量增加，微膠囊的粒徑增大，這是因為嗜酸乳桿菌的加入增大了料液固含量，在相同進料速度和氣速下，剪切得到的液滴尺寸略微增大；同時，由于嗜酸乳桿菌尺寸 為微米級，這也會導致料液在相同剪切力下被剪切成較大的液滴，因此，所制備的載菌海藻酸鈣微膠囊粒徑隨菌加入量增加而增大。

對所制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊進行了光學顯微鏡觀察，圖6為100×放大倍數(shù)下觀察的不同菌加入量制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊的光學顯微鏡照片。

圖6 含菌量為(A)108 CFU/mL，(B)109 CFU/mL， (C)1010 CFU/mL，(D)1011 CFU/mL制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊的光學顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 Optical micrographs of Lactobacillus acidophilus-loaded microcapsules with different Lactobacillus acidophilus

從圖6可以看出，當菌加入量為108和109CFU/mL時，制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊形態(tài)較完整、球形較佳，且分散性良好；當菌加入量增大至1010和1011CFU/mL時，制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊球形完整，但分散性較差，這可能是由于菌加入量的增大導致海藻酸鈣微囊固化不好，未固化好的凝膠與菌形成凝聚物，導致微膠囊間的粘連；另外，從光學顯微鏡照片也可以明顯看出，當菌加入量增加至1010和1011CFU/mL時，所制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊粒徑明顯增大。

將不同菌加入量制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊破壞，釋放出其中的嗜酸乳桿菌，對其活性進行了定量檢測，進而計算出微膠囊對嗜酸乳桿菌的包埋率。結果如圖7所示。

圖7 不同菌加入量制備的海藻酸鈣微膠囊對嗜酸乳桿菌的包埋率的影響Fig.7 Effect of different amounts of Lactobacillus acidophilus on encapsulation efficiency of Lactobacillus acidophilus-loaded microcapsules

結果表明，在菌加入量低于109CFU/mL時，隨菌加入量增加，微膠囊對嗜酸乳桿菌的包埋率增大，當菌加入量為109CFU/mL時，海藻酸鈣微膠囊對嗜酸乳桿菌的包埋率達最高；此時，繼續(xù)增加菌加入量，微膠囊對嗜酸乳桿菌的包埋率則隨菌加入量的增加而降低，表明109CFU/mL的菌加入量為最優(yōu)加入量，菌的過量加入并不提高微膠囊對嗜酸乳桿菌的包埋率。

2.2.2 最優(yōu)條件下制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊及表征

最終獲得的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊的最優(yōu)制備工藝參數(shù)如下：海藻酸鈉質量分數(shù)為1.5%、氣速為450 L/h、進料速度1 mL/min、菌加入量為109CFU/mL。在此最優(yōu)條件下，制備了載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊，其粒徑及粒徑分布圖、光學顯微鏡照片和掃描電鏡照片如圖8所示，結果顯示，微膠囊的平均粒徑為33.143 μm；光學顯微鏡結果顯示，大量嗜酸乳桿菌被包埋進微膠囊內(nèi)；包埋率測定結果顯示，所制備的海藻酸鈣微膠囊對活菌的包埋率為79.77%；通過超臨界干燥對載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊進行了干燥，掃描電鏡結果顯示，所制備的載菌微膠囊的呈球形，表面可見大量嗜酸乳桿菌被包埋在微膠囊內(nèi)。

圖8 載嗜酸乳桿菌微膠囊的粒徑及粒徑分布圖(A)、光學顯微鏡照片(B)、掃描電子鏡照片(C)Fig.8 Size and size distributions(A) , optical micrographs(B) and scanning electron micrographs(C)of Lactobacillus acidophilus-loaded microcapsules

3 結論

本研究以海藻酸鈉為壁材，采用噴射法結合離子固化法制備載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊，通過對空白海藻酸鈣微膠囊制備工藝進行了優(yōu)化，確定制備的最佳工藝條件為：海藻酸鈉質量分數(shù)為1.5%、氣速450 L/h、進料速度1 mL/min。在此最優(yōu)制備工藝條件下，考察了不同菌加入量對載嗜酸乳桿菌微膠囊粒徑及粒徑分布、形態(tài)及菌包埋率的影響，最終選取菌加入量為109CFU/mL進行載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊制備。結果顯示，制備的微膠囊粒徑為30 μm左右，菌包埋率達到79.77%以上。通過光學顯微鏡及掃描電子顯微鏡對微膠囊進行表征，微膠囊球形佳，粒徑小，分散性好，可滿足后續(xù)動物體內(nèi)評價需求。