雷慶子，王博，堵國(guó)成，方芳*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122 ) 3(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122 )

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)是一種存在于發(fā)酵食品中的2A類致癌物，具有遺傳毒性，可導(dǎo)致肺腫瘤、淋巴癌、肝癌和皮膚癌[1-2]。EC曾被用作抗腫瘤藥物，由于具有致癌性，現(xiàn)已停止臨床使用[3]。攝入體內(nèi)的EC經(jīng)細(xì)胞色素P450的羥基化作用和氧化作用生成可損傷DNA的8-羥基-脫氧鳥(niǎo)苷和乙烯基-氨基-甲酸酯環(huán)氧化物，通過(guò)破壞DNA結(jié)構(gòu)引發(fā)癌變[4-6]。

發(fā)酵食品中形成EC的主要前體包括氰化物、氨甲酰磷酸、尿素和瓜氨酸[7]。醬油生產(chǎn)過(guò)程中容易積累有害物氨基甲酸乙酯，這種現(xiàn)象在高鹽稀態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)醬油的過(guò)程中尤為顯著[8-9]。高鹽稀態(tài)醬油中，EC的主要前體是瓜氨酸，由乳酸菌通過(guò)精氨酸脫亞氨酶途徑(arginine deiminase pathway，簡(jiǎn)稱ADI途徑)代謝精氨酸生成[10-14]。ADI途徑包括3個(gè)關(guān)鍵酶：精氨酸脫亞氨酶(arginine deiminase, ADI)、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(omithine transcarbamylase, OTC)和氨基甲酰激酶(carbamate kinase, CK)，分別由arcA、arcB、arcC基因編碼[15-16]。由于醬油發(fā)酵是一個(gè)混菌發(fā)酵的食品體系，生產(chǎn)上不允許使用基因工程菌或用基因工程手段改造生產(chǎn)用菌株。通過(guò)內(nèi)源微生物干預(yù)是實(shí)現(xiàn)控制和減少醬油中EC及其前體的有效措施。

尋找來(lái)源于醬醪微生物體系并可利用精氨酸且不積累瓜氨酸的菌株，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中強(qiáng)化這一菌株來(lái)降低醬油中的EC前體瓜氨酸，可為建立消除食品混菌發(fā)酵體系中的有害微生物代謝物的方法提供研究基礎(chǔ)和理論支持。嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)是存在于醬油、泰國(guó)魚(yú)醬、果汁等高鹽或高糖環(huán)境中的一類乳酸菌[17-19]。它具有提升食品風(fēng)味、改善食品品質(zhì)的功能[20-21]。已有研究表明，來(lái)源于醬醪的嗜鹽四聯(lián)球菌R23可利用醬醪中的精氨酸和瓜氨酸，從而減少EC前體，起到控制EC含量的作用[22]。然而，體系中葡萄糖和精氨酸含量對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌利用或積累瓜氨酸均有顯著影響：當(dāng)體系中葡萄糖和精氨酸含量增加時(shí)，嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸和瓜氨酸能力顯著下降[22-23]。這說(shuō)明，嗜鹽四聯(lián)球菌用于醬油發(fā)酵時(shí)，其精氨酸和瓜氨酸利用能力受環(huán)境因素制約。因此，通過(guò)誘變育種的方法增強(qiáng)嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸和瓜氨酸的能力，對(duì)于發(fā)展醬油產(chǎn)業(yè)、控制或降低醬油中EC含量、提高發(fā)酵食品的安全性具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 菌株

嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)R23，分離自高鹽稀態(tài)醬油的醬醪，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號(hào)：CCTCCNo：M2013480)。

1.2 培養(yǎng)基

嗜鹽四聯(lián)球菌培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，MnSO40.05，乙酸鈉5，MgSO40.2，蔗糖10，牛肉膏5，檸檬酸三銨2，葡萄糖 10，吐溫80 1，酵母粉4，K2HPO42，NaCl 100，pH 7.2。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，吐溫80 1 ，MgSO40.2 ，蛋白胨5 ，MnSO40.05 ，葡萄糖0.5，F(xiàn)eSO40.4，檸檬酸三胺2，牛肉膏5，CaCO30.1，NaCl 100 ，吡哆醛-5-磷酸0.05，K2HPO42，瓜氨酸0.5，精氨酸3～4，pH 5.5。

復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，葡萄糖0.5，MgSO40.2，牛肉膏5，MnSO40.05， 蛋白胨5，F(xiàn)eSO40.4，檸檬酸三胺2，吐溫80 1，CaCO30.1，吡哆醛-5-磷酸0.05，K2HPO42，NaCl 180，瓜氨酸0.5，精氨酸3～5，pH 5.5。

氨基酸利用培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，NaCl 180，葡萄糖0.5，吐溫80 1，牛肉膏5，MgSO40.2，蛋白胨5，MnSO40.05，F(xiàn)eSO40.4，檸檬酸三胺 2，CaCO30.1，吡哆醛-5-磷酸0.05，K2HPO42，瓜氨酸 0.5，精氨酸5，pH 5.5。

1.3 主要試劑

色譜純甲醇、瓜氨酸、色譜純乙腈、分析純?nèi)纫宜?、鳥(niǎo)氨酸、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品、四氫呋喃、精氨酸購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。用于二乙酰一肟-氨基硫脲比色法顯色反應(yīng)的試劑如文獻(xiàn)所述[24-25]。培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(DP430)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FastQuant RT Kit (With gDNase)(KR106))購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。氨測(cè)定試劑盒(100M6204)購(gòu)自SIGMA公司。

1.4 誘變方法

將嗜鹽四聯(lián)球菌R23培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌3次后懸浮菌體，分別進(jìn)行紫外誘變和等離子誘變。

(1)紫外誘變

將菌液置于15 W紫外燈下30 cm處進(jìn)行紫外誘變，誘變時(shí)間分別為0、20、30、60、90、100、120 s。照射后菌液置于避光處?kù)o置培養(yǎng)30 min，避光稀釋涂平板，于30 ℃恒溫避光培養(yǎng)3 d。根據(jù)誘變致死率繪制誘變致死率曲線，選擇致死率在90%左右的誘變條件，確定為：距15 W紫外燈30 cm處、照射2 min。

(2)等離子誘變

取10 μL的菌懸液滴加在無(wú)菌載玻片上，用常壓室溫等離子體(ARTP)進(jìn)行等離子誘變，在功率100 W，通氣量為10 SLM條件下分別誘變0、1、3、5、7、10 s，然后轉(zhuǎn)移至含1 mL生理鹽水EP管中，將樣品梯度稀釋后涂布于嗜鹽四聯(lián)球菌培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。根據(jù)存活率繪制誘變致死率曲線，選擇致死率在95%左右的誘變劑量，確定誘變條件為：在功率100 W、通氣量為10 SLM條件下照射3 s。

1.5 突變株篩選

(1)高通量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)：挑取突變株單菌落，接種至分別含有1 mL，3、3.5、4 g/L精氨酸初篩培養(yǎng)基的96深孔板中，30 ℃培養(yǎng)5 d。

(2)初篩：利用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法測(cè)定瓜氨酸含量[26]，進(jìn)行誘變菌株初篩，利用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液530 nm處吸光值(OD530)，以未進(jìn)行誘變育種的嗜鹽四聯(lián)球菌R23的培養(yǎng)基比色測(cè)定吸光值作為對(duì)照組，選擇吸光值更小的突變株進(jìn)行復(fù)篩。

(3)復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種至有1 mL復(fù)篩培養(yǎng)基的深96孔板中，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，離心，利用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法分別測(cè)得在530 nm處吸光值(OD530)，以嗜鹽四聯(lián)球菌R23的培養(yǎng)基比色測(cè)定吸光值作為對(duì)照，選擇吸光值較其更小的突變株作為復(fù)篩菌株，并利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定復(fù)篩菌株培養(yǎng)體系中氨基酸含量，得到優(yōu)勢(shì)突變株。

1.6 氨基酸測(cè)定

利用HPLC測(cè)定體系中游離氨基酸的含量[26]。測(cè)定時(shí)取 1 mL菌液，10 000 r/min離心5 min，取上清液。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸將其稀釋5倍，用濾膜(0.22 μm)過(guò)濾稀釋液至液相瓶中，用HPLC測(cè)定濾液中瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸含量。測(cè)定條件為：色譜柱 ODS-2 HYPERSIL(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速：1 mL/min。檢測(cè)器為 VWD 紫外檢測(cè)器，柱溫 40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 338 nm，分離時(shí)間 38 min[10]。流動(dòng)相 A (1 L)：無(wú)水乙酸鈉 5 g，超純水 1 L，三乙胺 200 μL，四氫呋喃5 mL， pH 7.2。流動(dòng)相 B (1 L)：無(wú)水乙酸鈉 5 g，超純水200 mL，甲醇 400 mL，乙腈 400 mL， pH 7.2。

1.7 環(huán)境因素對(duì)突變株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響

將突變株和野生菌株R23接種至嗜鹽四聯(lián)球菌培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，離心收集菌體并用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌?？疾炱咸烟菨舛取囟纫约搬u油乙醇發(fā)酵時(shí)期環(huán)境因素對(duì)突變株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響時(shí)，菌體再用相應(yīng)氨基酸利用培養(yǎng)基垂懸，在30 ℃(考察溫度影響在設(shè)定溫度下培養(yǎng))靜置培養(yǎng)5 d，測(cè)定精氨酸和瓜氨酸的消耗量。

1.8 酶活的測(cè)定方法

粗酶液的制備：取30 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期嗜鹽四聯(lián)球菌菌液離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌后加入等體積的氨基酸利用培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 h，4 500 r/min離心 5 min 收集菌體。用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌并垂懸菌體，破壁取上清即得粗酶液。

(1)精氨酸脫亞胺酶(ADI)酶活的測(cè)定

在5 mL的EP管中加入150 μL的50 mmol/L精氨酸、2.3 mL的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)和50 μL粗酶液，37 ℃水浴30 min后用5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)代替粗酶液。用高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸含量，計(jì)算ADI酶活(ADI 酶活為稀釋倍數(shù)乘以單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化生成的瓜氨酸含量)。

(2)鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OTC)酶活的測(cè)定

在5 mL的EP管中加入160 μL的 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)、40 μL的25 mmol/L鳥(niǎo)氨酸溶液、150 μL的133 mmol/L 氨甲酰磷酸溶液、240 μL的粗酶液和600 μL的超純水，37 ℃水浴15 min后用5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)代替粗酶液。用高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸含量，計(jì)算 OTC 酶活(OTC 酶活為稀釋倍數(shù)乘以單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化生成的瓜氨酸含量)。

(3)氨基甲酸酯激酶(CK)酶活的測(cè)定

在1.5 mL的EP管中加入160 μL 的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)、200 μL的73 mmol/L的MgCl2溶液以及200 μL的50 mmol/L ADP，混勻后放置 10 min，加入200 μL的133 mmol/L氨甲酰磷酸溶液，混勻后繼續(xù)放置 10 min，向混合液中加入100 μL粗酶液，37 ℃水浴15 min后用5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)代替粗酶液。將反應(yīng)液稀釋一定倍數(shù)后，按照氨測(cè)定試劑盒(SIGMA公司)中的測(cè)定方法測(cè)定CK酶活(CK酶活為稀釋倍數(shù)乘以單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化生成的NH3含量)。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR法分析基因轉(zhuǎn)錄水平

將嗜鹽四聯(lián)球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌3遍后分別垂懸于含4 g/L和5 g/L精氨酸的氨基酸利用培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)4 h。低速離心獲得菌體，與2 mL RNA 穩(wěn)定劑混合，-80 ℃保藏。采用液氮研磨的方式對(duì)上述獲得的菌體進(jìn)行破壁。用培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取RNA并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FastQuant RT Kit (With gDNase) (天根生化科技(北京)有限公司)制備cDNA。qRT-PCR使用的引物如表1所示，選擇16S rRNA作為內(nèi)參基因。使用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析[27]。

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物Table 1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果和分析

2.1 嗜鹽四聯(lián)球菌誘變育種及高效利用瓜氨酸突變株篩選

嗜鹽四聯(lián)球菌R23在精氨酸質(zhì)量濃度低于3 g/L時(shí)可利用醬醪中的精氨酸且不積累EC前體瓜氨酸，但是當(dāng)精氨酸含量高于3 g/L時(shí),體系中瓜氨酸開(kāi)始積累[22]。為獲得精氨酸和瓜氨酸利用能力提高的菌株，通過(guò)誘變嗜鹽四聯(lián)球菌R23，共得到紫外誘變突變株386株，等離子誘變突變株237株。采用二乙酰-肟-氨基硫脲比色法確定瓜氨酸相對(duì)含量的篩選方法，用于突變株的初篩(圖1)[25]。

圖1 嗜鹽四聯(lián)球菌誘變及突變株篩選Fig.1 Mutagenesis of Tetragenococcus halophilus and screening of mutants

通過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得了4株在精氨酸質(zhì)量濃度高于3 g/L時(shí)，瓜氨酸積累少于出發(fā)菌株R23的突變株，分別命名為1-A2，1-A10，5-H1和3-H9(圖2)。

圖2 嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸和積累瓜氨酸能力分析Fig.2 Conversion of citrulline from arginine by T. halophilus 1-A2,1-A10,5-H1 and 3-H9，mutants of T. halophilus R23

2.2 嗜鹽四聯(lián)球菌突變株利用精氨酸和瓜氨酸的能力

為進(jìn)一步確定突變株利用精氨酸和瓜氨酸的能力，以及尋找具有有效降低醬油中EC含量潛力的菌株，分別對(duì)4株嗜鹽四聯(lián)球菌突變株利用精氨酸和瓜氨酸的能力進(jìn)行了分析和比較(圖3)。

圖3 嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸和瓜氨酸的能力比較Fig.3 Utilization of arginine and citrulline by T. halophilus 1-A2,1-A10,5-H1 and 3-H9，mutants of T. halophilus R23

由圖3可以看出，當(dāng)體系中含有0.5 g/L瓜氨酸和3、4、5 g/L精氨酸時(shí)，突變株3-H9利用精氨酸能力最高，比R23提高了0.6～2.49倍。突變株3-H9利用瓜氨酸能力也比R23提高了0.74～56倍。突變株5-H1精氨酸利用能力下降，瓜氨酸利用能力沒(méi)有顯著提高。突變株1-H10和1-A2利用精氨酸的能力比R23略有提高，但對(duì)瓜氨酸的利用能力遠(yuǎn)低于突變株3-H9。因此，選擇突變株3-H9進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 環(huán)境因素對(duì)突變株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響

ADI途徑是細(xì)菌獲得能量的一條輔助代謝途徑。當(dāng)培養(yǎng)體系中還原糖充足時(shí)菌株優(yōu)先利用還原糖供能，因此ADI途徑代謝通量會(huì)受到還原糖的抑制[10]。由于乙醇和游離脂肪酸的協(xié)同作用，細(xì)菌通過(guò)ADI途徑代謝精氨酸時(shí)，會(huì)積累瓜氨酸，對(duì)EC前體含量的有效控制時(shí)期為醬油發(fā)酵前期，即乳酸發(fā)酵時(shí)期[28]。在醬油發(fā)酵前期(1～7 d)，醬醪中葡萄糖的質(zhì)量濃度為0～7 g/L[29]。通過(guò)考察葡萄糖濃度對(duì)突變株利用精氨酸、瓜氨酸能力的影響發(fā)現(xiàn)，葡萄糖質(zhì)量濃度大于2 g/L時(shí)野生菌株R23已不能消耗精氨酸，而突變株3-H9在葡萄糖質(zhì)量濃度為7 g/L時(shí)仍能利用精氨酸。突變株3-H9利用精氨酸的能力在葡萄糖質(zhì)量濃度為2、3、5、7 g/L時(shí)，分別比R23提高 5.05、5.62、3.41、1.22 g/L(表2)。這說(shuō)明，突變株3-H9精氨酸代謝受葡萄糖抑制作用被減弱，具有進(jìn)一步減控醬油中EC前體的潛力。

表2 葡萄糖對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響Table 2 Effects of glucose concentration on arginine and citrulline utilization of T. halophilus mutants

注： ΔArg為精氨酸消耗量；ΔCit為瓜氨酸消耗量； ΔOrn為鳥(niǎo)氨酸生成量。

高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程前期溫度較低，為了研究溫度對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌突變株利用精氨酸能力的影響，考察了突變株3-H9在20、25、30 ℃條件下利用精氨酸能力。由表3可知，溫度低于30 ℃時(shí)，突變株3-H9和野生菌株R23利用瓜氨酸和生成鳥(niǎo)氨酸的能力均有所減弱。較低溫培養(yǎng)條件下，突變株3-H9利用精氨酸的能力高于野生菌株R23。在20、25 ℃培養(yǎng)時(shí)，3-H9利用精氨酸能力分別比R23提高57.7%和47.8%(圖4)。

表3 溫度對(duì)突變株利用瓜氨酸能力的影響Table 3 Effects of temperature on the use of citrulline in mutant strains

注：ΔCit為瓜氨酸消耗量(g/L)； ΔOrn為鳥(niǎo)氨酸生成量(g/L)。

圖4 溫度對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸的影響Fig.4 Effect of temperature on arginine utilization of T. halophilus

醬油發(fā)酵過(guò)程中，瓜氨酸的積累有2個(gè)時(shí)期：一是乳酸發(fā)酵時(shí)期，占主導(dǎo)地位的微生物是乳酸菌(主要為魏斯氏菌屬和足球菌屬的菌株)，二是乙醇發(fā)酵時(shí)期，葡萄球菌屬、微球菌屬和芽孢桿菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群[28,30-31]。乙醇發(fā)酵時(shí)期醬醪中含有的乙醇和游離脂肪酸是導(dǎo)致細(xì)菌利用精氨酸積累瓜氨酸的主要因素。因此，我們考察了突變株3-H9在含有2%的乙醇與0.25%游離脂肪酸(模擬醬油乙醇發(fā)酵時(shí)期)的培養(yǎng)體系中利用精氨酸的情況。由表4可知，在此條件下，野生菌株R23不利用精氨酸，而突變株3-H9仍可利用精氨酸。由于突變株3-H9在這一培養(yǎng)條件下利用精氨酸積累了瓜氨酸，因此它更適用于在醬油乳酸發(fā)酵時(shí)期發(fā)揮作用。

表4 乙醇和游離脂肪酸對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響Table 4 Effect of ethanol and fatty acids on arginine and citrulline utilization of T. halophilus

注： ΔArg為精氨酸消耗量；ΔCit為瓜氨酸消耗量； ΔOrn為鳥(niǎo)氨酸生成量。

2.4 突變株瓜氨酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平及酶活分析

細(xì)菌對(duì)精氨酸的利用以及瓜氨酸的生成和消耗與ADI途徑中3種關(guān)鍵酶：精氨酸脫亞胺酶(ADI)、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OTC)和鳥(niǎo)氨酸氨基甲酸激酶(CK)密切相關(guān)。由表5結(jié)果可知，突變株3-H9較R23相比，ADI酶、OTC酶和CK酶活性分別提高了27%、38%和0.4%，說(shuō)明突變株3-H9利用精氨酸和瓜氨酸的能力都比出發(fā)菌株高。

表5 突變株及野生菌株中 ADI、OTC、CK酶酶活分析Table 5 Activity of ADI,OTC,CK in mutant and wild strains

ADI酶、OTC酶和CK酶是分別由arcA、arcB和arcC基因編碼。為了探明突變株3-H9利用精氨酸和瓜氨酸能力及調(diào)控水平變化的原因，對(duì)突變株3-H9和野生菌株R23arc基因簇轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了比較分析。由圖5可知，突變株3-H9中arcA、arcB和arcC轉(zhuǎn)錄水平分別比R23提高了7.9倍、9.5倍和7.8倍。在ADI途徑中，arcA編碼的ADI酶催化精氨酸向瓜氨酸轉(zhuǎn)化，arcB基因編碼的OTC酶催化瓜氨酸向鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化。通過(guò)比較arcA與arcB基因表達(dá)水平可以得知該條件下ADI途徑產(chǎn)物是終產(chǎn)物鳥(niǎo)氨酸，還是含有中間產(chǎn)物瓜氨酸。此途徑中，若arcA/arcB大于1，表現(xiàn)為瓜氨酸積累，arcA/arcB小于1則表現(xiàn)為瓜氨酸利用。通過(guò)對(duì)突變株3-H9和野生菌株R23的arcA/arcB轉(zhuǎn)錄水平之比分析發(fā)現(xiàn)：在4 g/L精氨酸濃度下，兩株菌arcA/arcB比值均小于1，均表現(xiàn)為利用瓜氨酸；當(dāng)精氨酸濃度為5 g/L時(shí)，野生菌arcA/arcB>1，表現(xiàn)為積累瓜氨酸，而突變株3-H9arcA/arcB<1，表現(xiàn)為利用瓜氨酸(表6)。

圖5 ADI途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.5 Transcriptional analysis of arc genes in T. halophilus

菌株精氨酸/(g·L-1)arcA/arcBR23450.756 71.099 63-H9450.564 80.906 8

3 結(jié)論

本研究以對(duì)醬油風(fēng)味有強(qiáng)化作用的內(nèi)源微生物嗜鹽四聯(lián)球菌為出發(fā)菌株，通過(guò)等離子和紫外誘變的方法獲得了1株利用精氨酸和瓜氨酸能力顯著提高的嗜鹽四聯(lián)球菌突變株3-H9。該突變株具有減少醬油中氨基甲酸乙酯前體瓜氨酸的應(yīng)用潛力。研究結(jié)果提供了一種通過(guò)改造發(fā)酵食品體系中某一有益菌的氮源代謝方式來(lái)減少發(fā)酵食品中有害物的策略，可為控制或降低醬油中氨基甲酸乙酯及其前體提供理論依據(jù)，對(duì)于提高嗜鹽四聯(lián)球菌的工業(yè)應(yīng)用性能以及發(fā)展醬油產(chǎn)業(yè)，提高食品的安全性具有有利意義。