侯金珍，裴世成，王云，盧慧英，韋水連，李冬明，韋啟球（通訊作者）

（1.柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 柳州 545005）

0 引言

扛板歸為一年生雙子葉草本植物，全國(guó)各地均分布，屬于蓼科蓼屬植物扛板歸（Polygonum perfoliatum L.）的地上部分。又稱蛇見(jiàn)退、蛇牙草、河白草等。其具有多種藥理功效，如活血化瘀、利濕消腫、清熱解毒等等。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，扛板歸具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗誘變、降血壓、抗腫瘤和止血等生物活性[1-2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外主要是對(duì)扛板歸的黃酮類、蒽醌類、苯丙素等成分進(jìn)行較多的研究報(bào)[3-4]。但對(duì)扛板歸石油醚提取部位和扛板歸水提液不同極性部位的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道都比較少。

本實(shí)驗(yàn)以扛板歸為原料，依次分別用石油醚和水回流提取扛板歸，得扛板歸石油醚提取部位和水提取物；水提取物分別用乙醇沉淀和不同極性的有機(jī)溶劑萃取等方法，得水提取物不同極性部位?？疾炜赴鍤w不同極性部位對(duì)自由基的清除作用，評(píng)價(jià)它們的抗氧化能力，為中藥扛板歸在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)和進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)扛板歸奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

FD-IA50真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），SF-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（泰州市天泰制藥機(jī)械廠），UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（株式會(huì)社島津制作所），XW-80A旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），DHG-9241A電熱恒溫干燥箱（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），HH-1水浴鍋（常州蒙特儀器制造有限公司），F(xiàn)A2204B分析天平（上海精科儀器有限公司），SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，德國(guó)），二甲基亞砜（DMSO，AR，成都市科龍化工試劑廠），抗壞血酸（Vc ，AR，天津市福晨化學(xué)試劑廠），1，10-菲啰啉（1 H2O，AR，天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心），硫酸亞鐵（7H2O，AR，成都市科龍化工試劑廠），其他試劑均為市售分析純。

藥材采自廣西壯族自治區(qū)柳州市郊區(qū)（2016年7月28日），經(jīng)廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院韋運(yùn)東副教授鑒定為蓼科蓼屬植物扛板歸（Polygonum perfoliatum L.）的干燥地上部分。

1.2 樣品的制備

取扛板歸原藥材，干燥，粉碎（40目），取100 g，加30倍體積量（30 mL/g）的石油醚回流提取2 h。重復(fù)提取一次。減壓抽濾，合并兩次提取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收石油醚，收集石油醚提取浸膏，經(jīng)冷凍干燥，得扛板歸石油醚提取部位（A）；同時(shí)收集藥渣，揮干石油醚，待用。

取石油醚回流提取過(guò)的扛板歸粉末50 g，30倍體積量（30 mL/g）的蒸餾水回流提取 1.5 h。重復(fù)提取一次。在4000 r/min的條件下，離心機(jī)離心10 min，收集離心后的上清液，合并兩次提取的上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積。在攪拌的作用下，緩慢向濃縮液中加入4倍濃縮液體積量的無(wú)水乙醇，4 ℃條件下放置12 h ，4000 r/min條件下，離心機(jī)離心10 min，收集沉淀物，冷凍干燥，即得扛板歸醇沉物部位（B）；乙醇液相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇至無(wú)醇味后，分散在一定體積純化水中，依次用等體積的、不同極性的有機(jī)溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇（水飽和）充分萃取數(shù)遍。各有機(jī)相分別回收有機(jī)溶劑后得各有機(jī)相萃取物浸膏，經(jīng)冷凍干燥，依次得扛板歸石油醚萃取部位（C）、扛板歸氯仿萃取部位（D）、扛板歸乙酸乙酯萃取部位（E）和扛板歸正丁醇萃取部位（F）。殘余的水相經(jīng)濃縮后，浸膏經(jīng)冷凍干燥，得扛板歸水相殘余物部位（G）。收集扛板歸不同極性部位A、B、C、D、E、F和G，備用。

1.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的方法參照Li[5]報(bào)道的方法，稍作改變。用DMSO分別配制濃度為4.0 mg/mL的樣品作為母液。在序列試管中分別加入0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0 mL 的母液，分別補(bǔ)DMSO至1.0 mL（在反應(yīng)液中終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。每管加入 3 mL的0.1 mmol/L溶于80%（V/V）乙醇的DPPH溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）；樣品對(duì)照組中用80%乙醇代替DPPH溶液；空白組中用DMSO代替樣品溶液。以上各實(shí)驗(yàn)組溶液混勻后，置黑暗處，室溫放置30 min。于517 nm處、1 cm光徑，用1 mL DMSO和3 mL 80%乙醇溶液調(diào)零。依次測(cè)量各管吸光度值。Vc為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)測(cè)試管做兩個(gè)平行，結(jié)果取平均值。按如下公式計(jì)樣品對(duì)DPPH自由基百分清除率：DPPH清除率%=100×[A空白–（A樣-A樣對(duì)）]/A空白

1.3.2 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)

羥自由基清除活性的測(cè)定方法參照Motoko[6]報(bào)道的方法，稍作改變。用DMSO配制濃度為4.5 mg/mL的樣品作為母液。在序列試管中分別加入0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 4 .5 mg/mL的母液，分別補(bǔ)DMSO至1mL（在反應(yīng)液中終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）， 即 得序列濃度的樣品組。樣品組中每管依次加入0.5 mL pH7.4 緩沖液、1 mL 7.5 mmoL/L的 1，10-菲啰啉、1.5 mL 0.75 mmoL/L FeSO4 和0.5 mL 3% H2O2后，置于37 ℃水浴中保溫1 h。于536 nm處，1 cm光徑，純化水調(diào)零，測(cè)量各管吸光度。對(duì)照組用1 mL DMSO代替樣品；空白組用1.5 mL DMSO代替1 mL樣品和0.5 mL 3% H2O2。Vc為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)測(cè)試管做兩個(gè)平行，結(jié)果取平均值。按如下公式計(jì)樣品對(duì)羥自由基百分清除率：

1.4 數(shù)據(jù)的處理

采用Origin 7.5 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基屬于有機(jī)氮自由基，其結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)苯環(huán)，夾在三個(gè)苯環(huán)中間有一個(gè)氮原子，該氮原子上有一個(gè)不成對(duì)的單電子。DPPH自由基能穩(wěn)定地溶解在有機(jī)溶劑中，呈深紫色，該溶液在517 nm處有強(qiáng)吸收峰。由于DPPH自由基有單電子的存在，故其能接受一個(gè)電子，當(dāng)溶液中有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基的單電子被配對(duì)，使其顏色變淺，從而在517 nm處吸光值會(huì)下降，且下降程度與配對(duì)電子數(shù)呈線性關(guān)系。因此可采用紫外可見(jiàn)分光光度儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)自由基的清除作用，間接的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品的抗氧化能力[7]。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，是評(píng)價(jià)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛的一種實(shí)驗(yàn)方法之一。

扛板歸不同極性部位對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖1。由圖1可知，各部位的提取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，隨著樣品濃度的增大，清除作用也不斷增強(qiáng)，具有一定的量效相關(guān)性。當(dāng)濃度達(dá)到1000 ug/mL時(shí)，提取部位A、B、C、D、E、F和G的清除率分別達(dá)到61.43%、94.08%、86.43%、88.78%、87.43%、91.55%和92.72%。結(jié)果表明，扛板歸不同極性部位對(duì)DPPH自由基均具有良好的清除能力。

2.2 清除羥自由基實(shí)驗(yàn)

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，自由基（Free radical）是指含有未配對(duì)電子的原子、分子或基團(tuán)。目前對(duì)以碳、氮和氧為中心的活性基團(tuán)研究較多，其中對(duì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的研究最為活躍。ROS主要是羥自由基、單線態(tài)氧和超氧陰離子等。自由基，其實(shí)是人體內(nèi)正常新陳代謝的產(chǎn)物，一般情況下，自由基在 體內(nèi)趨于動(dòng)態(tài)平衡。但是當(dāng)這一平衡失調(diào)，自由基就會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，進(jìn)而引發(fā)一系列相關(guān)疾病[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，由ROS引起的疾病，已超過(guò)100余種，如高血壓、癌癥、糖尿病、老癡呆癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[9-10]?？寡趸瘎┛蓪?duì)體內(nèi)多余的自由基起到清除作用，控制和減少自由基失衡時(shí)自由基對(duì)人體造成的損害。

扛板歸不同極性部位對(duì)羥自由基清除作用結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，提取部位B和提取部位E隨著樣品濃度的增加，對(duì)羥自由基清除率也在不斷上升，濃度由25-1000 ug/mL時(shí)，清除率分別由0.33% - 93.80%和0.46% - 68.45%。其它極性提取部位的清除作用在該濃度下相對(duì)較弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，扛板歸提取物對(duì)羥自由基有很強(qiáng)的清除活性，活性部位主要集中在水提液醇沉部位（B）和水提液乙酸乙酯萃取部位(E)。

圖1 提取物清除DPPH自由基活性Fig.1 Scavenging activity of extractson DPPHradical

圖2 提取物清除羥自由基活性Fig.2 Scavenging activity of extractsonhydroxyl radical

3 結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扛板歸不同溶劑提取物具有良好的抗氧化活性?？寡趸钚猿煞种饕性谒嵋捍汲敛课缓退嵋阂宜嵋阴ポ腿〔课?。為中藥扛板歸在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)和進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)扛板歸奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。