楊金松，王愛軍，張?jiān)倬?

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北武漢430064；2.糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，四川成都611130）

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種土傳性真菌病害，該病原菌可產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)、在土壤中存活和傳播中起關(guān)鍵作用的菌核結(jié)構(gòu)，防控難度極大，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)可造成水稻減產(chǎn)50%，現(xiàn)已成為制約我國(guó)南方水稻高產(chǎn)的第一大病害[1-2]。生產(chǎn)中長(zhǎng)期單一使用化學(xué)藥劑，不僅使病原菌產(chǎn)生抗藥性、污染環(huán)境，高劑量的農(nóng)藥殘留還會(huì)危及人類健康，同時(shí)對(duì)土壤中有益微生物也產(chǎn)生抑制作用[3]。生物防治對(duì)環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全，因此在防治水稻紋枯病中發(fā)揮著越來越重要的作用。開發(fā)新的有益微生物資源是生物防治的前提。

芽孢桿菌（Bacillus spp.）能產(chǎn)生耐熱抗逆的內(nèi)生芽胞，不僅分泌多種抑菌化合物，還可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。目前，性狀優(yōu)良的菌株資源已成功用于植物病害的防控[4-5]。李全勝等研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌S12的發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病病原大麗輪枝菌具有明顯的抑制效果[6]；黃秋斌等研究表明，蠟樣芽孢桿菌B3-7在大田條件下對(duì)小麥紋枯病菌具有良好的防治效果[7]；喬俊卿等研究了枯草芽孢桿菌Bs916對(duì)番茄青枯病的防治作用，發(fā)現(xiàn)菌株Bs916可以影響番茄根表及莖內(nèi)青枯病菌種群的數(shù)量，且對(duì)番茄植株具有促生作用[8]。

湖北是我國(guó)水稻種植大省，由立枯絲核菌（R.solani）引起的紋枯病是湖北水稻種植區(qū)的主要病害。為充分發(fā)掘利用水稻田已有的生防微生物資源，篩選出強(qiáng)拮抗水稻紋枯病菌的芽胞桿菌菌株，本研究從水稻田植株周圍耕作層土壤中分離并篩選對(duì)立枯絲核菌具有抑制作用的芽胞桿菌菌株，為水稻紋枯病的防治和生防制劑的研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

采用5點(diǎn)取樣法，采樣點(diǎn)位于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田中，于水稻揚(yáng)花期采集根際0～20 cm的土樣用于分離芽孢桿菌菌株。每個(gè)種植小區(qū)采集5個(gè)點(diǎn)，混勻，共16份土樣，保存于-20℃冰箱，備用。

1.2 供試靶標(biāo)病原菌

供試靶標(biāo)病原菌為水稻紋枯病強(qiáng)致病力菌株R.solaniAG1 IA，用于篩選生防芽孢桿菌菌株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：稱取10 gNaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母膏、16g瓊脂加入1000mL蒸餾水中溶解，115℃高壓滅菌20 min。

LB培養(yǎng)液：LB培養(yǎng)基不加瓊脂。

PDA培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯240 g去皮，切成1 cm左右方塊，加1 000 mL蒸餾水煮沸10 min，過濾，加入葡萄糖10 g、瓊脂15 g，115℃高壓滅菌20 min。

1.4 芽孢桿菌的分離純化

每份土樣稱取1 g置于無菌三角瓶中，加入無菌蒸餾水99 mL，混勻，80℃水浴處理10 min[9]，制得土壤懸浮液。根據(jù)預(yù)試結(jié)果，采用10倍稀釋法[10]，將土壤懸浮液稀釋105倍。取105倍稀釋液0.5 mL均勻涂布于LB培養(yǎng)基上，重復(fù)3次。30℃恒溫培養(yǎng)箱中放置2 d，挑取單菌落純化培養(yǎng)24 h，置于60%甘油中保存，放于-20℃冰箱備用。以上試驗(yàn)均在無菌條件下操作。

1.5 拮抗芽孢桿菌的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選對(duì)病原菌有拮抗作用的芽孢桿菌菌株。將靶標(biāo)菌于PDA培養(yǎng)基上活化，打取菌落邊緣直徑為6 mm菌餅，倒置于PDA培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)24 h后，在距菌餅20 mm處上、下、左、右分別對(duì)稱點(diǎn)接4株待測(cè)芽孢桿菌菌株，重復(fù)3皿。于26～28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 d后觀察芽孢桿菌抑菌情況，測(cè)量抑菌圈半徑并拍照處理。

1.6 拮抗芽孢桿菌菌株的鑒定

1.6.1 形態(tài)特征與生理生化特性。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]。

1.6.2 拮抗芽孢桿菌菌株基因組DNA的提取及檢測(cè)。將純化的芽孢桿菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min培養(yǎng)16 h，取1 mL菌液，10 000 r/min離心1 min收集菌體。采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司提供]提取菌株DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.3gyrB序列分析。以“1.6.2”節(jié)中提取的拮抗芽孢桿菌菌株DNA為模板，gyrB-1（TTGRCGGHRGY GGHTATAAAGT）、gyrB-2（TCCDCCSTCAGARTCW CCCTC）為正、反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增菌株的gyrB片段[12]，1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，送成都擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用BLAST程序，將測(cè)序所得序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用DNAstar軟件中的MegAlign程序?qū)⒈葘?duì)結(jié)果同源性較高的芽孢桿菌登記菌株序列與所得序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

從16份土樣中共篩選到96株芽孢桿菌菌株，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，得到1株抑菌帶寬度＞5 mm的菌株 Q9-0-1（圖 1），5株 4～5 mm的菌株，14株3～4 mm的菌株，26株2～3 mm的菌株，50株0～2 mm的菌株（表1）。

2.2 菌株Q9-0-1的鑒定

2.2.1 菌株Q9-0-1的形態(tài)學(xué)與生理生化特征。將拮抗芽孢桿菌菌株Q9-0-1在LB瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)為不規(guī)則形，直徑2 mm左右，顯微黃色，表面有突起或褶皺，產(chǎn)生橢圓形芽孢。其生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2。

表1 拮抗芽孢桿菌菌株篩選結(jié)果

2.2.2 菌株Q9-0-1的gyrB序列分析。PCR擴(kuò)增后，得到了1 200 bp左右清晰的條帶（圖2）。經(jīng)測(cè)序，得到了大小為1 080 bp的堿基序列。將所得序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，拮抗菌株Q9-0-1與Genbank登記的B.pumilus（AUEM104）、B.pumilus（AUEM12）、B.pumilus（AUES82）、B.pumilus（KYC24）、B.pumilus（ATCC 27142）、B.pumilus（LNXM12）、B.pumilus（NMTD17）、B.pumilus（MZGC1）和B.pumilus（KYC18）9 株菌株的同源性達(dá)99%。選取這9株菌株與菌株Q9-0-1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可知，Q9-0-1與菌株B.pumilus（LNXM12）處于最小分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合其形態(tài)特征與生理生化測(cè)定結(jié)果，將其鑒定為短小芽孢桿菌（B.pumilus）[11]。

表2 菌株Q9-0-1的生理生化特性

圖1 芽孢桿菌菌珠Q9-0-1（右）對(duì)立枯絲核菌的拮抗效果

圖2 芽孢桿菌菌珠Q9-0-1PCR擴(kuò)增條帶

圖3 菌株Q9-0-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

土壤中含有大量的有益微生物資源，部分可以通過人工培養(yǎng)分離獲得。本研究從水稻根際分離到96株芽孢桿菌菌株，通過對(duì)水稻紋枯病菌的拮抗篩選，得到49株抑菌帶寬度大于2 mm的菌株，占分離總數(shù)的51%，這些菌株都可以進(jìn)一步開發(fā)利用，有望應(yīng)用于農(nóng)作物的生產(chǎn)中。

對(duì)細(xì)菌的分類鑒定是細(xì)菌研究的重要基礎(chǔ)性工作之一，16SrDNA序列分析是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法[13]。但是，由于16SrDNA序列具有高度的保守性，其分析鑒定細(xì)菌的方法有一定的局限性，難以分辨親緣關(guān)系較近的種[14]。gyrB基因編碼DNA促旋酶的β亞單位蛋白，在不改變氨基酸序列前提下，其特有的遺傳密碼子兼并性可使DNA序列發(fā)生較多的變異，gyrB基因序列較非蛋白編碼基因16S rDNA更能精確區(qū)分和鑒定芽孢桿菌的近緣種。Wang等使用16SrDNA序列分析了8個(gè)枯草芽孢桿菌群的系統(tǒng)發(fā)育，無法準(zhǔn)確區(qū)分相似度在98%以上的亞群，而采用gyrB基因序列可精確區(qū)分其亞群[15]。

利用有益微生物對(duì)植物病蟲害進(jìn)行防控已經(jīng)成為目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的趨勢(shì)，芽孢桿菌屬細(xì)菌，其因獨(dú)特的生物學(xué)特性更具有廣泛的應(yīng)用前景，已有多種芽孢桿菌制劑成功用于農(nóng)作物病蟲防治中。張學(xué)君等報(bào)道了生防菌B3制劑對(duì)小麥紋枯病具有較好的田間防效[16]；枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（百抗）可用于水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病的防治，并已推廣至多個(gè)省份，施用面積達(dá)4 667 hm2[17]。本研究篩選到的短小芽孢桿菌Q9-0-1菌株在室內(nèi)平板條件下對(duì)水稻紋枯病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，可進(jìn)一步驗(yàn)證其田間防治效果，為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供了一種有效的菌種資源。