談國(guó)蕾，孫梅，王建芳，吳旭平

HBV感染所致的肝硬化（liver cirrhosis，LC）、肝衰竭（liver failure，LF）和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）較為常見[1]。白細(xì)胞介素 -28B（in terleukin 28B，IL-28B）基因作為一個(gè)重要的細(xì)胞因子基因，具有影響抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用，在HBV感染進(jìn)程中有著重要的作用[2，3]。本研究檢測(cè)了HBV感染者外周血IL-28B基因rs8099917和rs12979860多態(tài)性，以探討其與乙型肝炎病程進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究對(duì)象為2013年1月～2014年12月南京市第二醫(yī)院門診及住院的HBV感染者。按照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]對(duì)疾病診斷并分組如下：無癥狀攜帶者（asymptotic HBV carriers，ASC）45例，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者181例，LC患者69例，HCC患者79例，LF患者79例。另選同期在我院健康體檢者145例作為對(duì)照。所有人群無重疊或混合其他病毒感染，入選對(duì)象均為江蘇籍漢族人群。

1.2 外周血IL-28B基因多態(tài)性檢測(cè) 取外周血，EDTA抗凝，采用QIAGEN公司的DNA Blood Kit提取DNA，直接用于PCR擴(kuò)增或者保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)NCBI上IL-28B基因序列設(shè)計(jì)引物。rs12979860位點(diǎn)上游引物rs860-F：CTTATCGCATACGGCTAGGC，下游引物 rs860-R：GGACCGCTACGTAAGTCACC。rs8099917位點(diǎn)上游引物rs917-F：TTCACCATCCTCCTCTCATCCCTCAT，下游引 物 rs917-R：TCCTAAATTGACGGGCCATCTGTTTC。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，55℃ 30 s,72℃ 30 s；共 35 個(gè)循環(huán)，最后，72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物用QIAGEN公司QIA Quick PCR Purification kit進(jìn)行產(chǎn)物純化。將純化后的PCR產(chǎn)物送南京金思瑞生物科技公司測(cè)序。分析和記錄IL-28B rs8099917和rs12979860位點(diǎn)的基因型和等位基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Pearson x2檢驗(yàn)對(duì)IL-28B rs8099917與rs12979860位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析、x2檢驗(yàn)和Binary Logistic回歸分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組人群的臨床特點(diǎn) 453例HBV感染者年齡和性別比較見表1，ASC患者中男性比例顯著少于健康人群（x2=10.991，P=0.001），LC 患者中男性比例顯著高于健康人群（x2=7.684，P=0.006）。LC患者、HCC患者和LF患者的年齡顯著大于健康人群（P＜0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 對(duì)健康人群IL-28B基因2個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行平衡檢驗(yàn)，經(jīng)擬合優(yōu)度x2檢驗(yàn)，各個(gè)基因型分布實(shí)際值近似于推算獲得的期望值，提示這些rs8099917與rs12979860位點(diǎn)處于遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05），表明用于本研究的對(duì)照樣本具有群體代表性，對(duì)照組中多態(tài)性位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 各組人群年齡和性別（n,±s）比較

表1 各組人群年齡和性別（n,±s）比較

與健康組比，①P<0.05

健康人（n=145） ASC（n=45） CHB（n=181） LC（n=69） HCC（n=79） LF（n=79）性別（男/女） 98/47 18/27① 135/46 59/10① 63/16 54/25年齡(歲) 35.3±14.2 35.7±8.6 36.6±12.5 47.8±11.3① 55.5±10.0① 45.8±12.8①

表2 對(duì)照人群多態(tài)性位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 rs12979860位點(diǎn)基因型和等位基因分布情況 在本地區(qū)人群中，IL-28B基因rs12979860位點(diǎn)有三種基因型，即CC、CT和TT，以CC和CT為主要基因型，TT型只在健康人群和CHB患者中存在。ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者CC型頻率與健康人群無顯著性差異（P=0.797，P=0.422，P=0.428，P=0.997），只有LF人群中CC型頻率顯著高于健康人群（P=0.045），提示CC型與LF的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（OR=0.257）。ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者C等位基因頻率與健康人群無顯著性差異（P=0.685，P=0.406，P=0.352，P=0.907），只有 LF 患者顯著高于健康人群（P=0.038），提示C等位基因與LF的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（OR=0.255，表3）。

表3 IL-28B基因rs12979860基因型和等位基因頻率（%）分布

2.4 rs8099917位點(diǎn)的基因型和等位基因分布情況 在本地區(qū)人群中，IL-28B基因rs8099917位點(diǎn)有三種基因型，即 TT、TG、GG，以 TT、TG 為主要基因型。GG型只在健康人群和CHB患者中存在。LC患者TT型頻率顯著高于健康人群（P=0.041），而ASC、CHB患者、HCC患者、LC患者與健康人群無顯著性差異（P=0.414，P=0.245，P=0.179，P=0.323），提示TT型與肝硬化的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（OR=0.288）。ASC、CHB患者、HCC患者、LF患者與健康人群差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.540，P=0.245，P=0.166，P=0.264），只有LC患者T等位基因比例顯著高于健康人群（P=0.036），提示T等位基因與LC的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（OR=0.299，表 4）。

表4 IL-28B基因rs8099917基因型和等位基因頻率（%）分布

3 討論

本研究分析了IL-28B基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)（即rs8099917和rs12979860）在健康人群與ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者和LF患者中的分布。結(jié)果表明，在健康人群和CHB患者或HCC患者中這兩個(gè)位點(diǎn)分布都無顯著性差異，即rs8099917和rs12979860位點(diǎn)多態(tài)性與HBV感染引起的CHB或HCC無明顯相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的這個(gè)結(jié)果與國(guó)外學(xué)者]在健康人群和CHB患者中的結(jié)果，rs8099917和rs12979860基因型和等位基因分布無顯著性差異是一致的[5-9]。

但是，IL-28B rs12979860和rs8099917多態(tài)性與HCC是否相關(guān)有著不同的結(jié)論。其他相關(guān)研究[10-12]表明，IL-28B rs12979860位點(diǎn)T等位基因在HCC患者中更普遍存在，而本研究與Akkiz[13]發(fā)現(xiàn)的rs-12979860位點(diǎn)在健康人群和HCC患者無顯著性差異的結(jié)果是一致的。尚有其他報(bào)道[8,14，15]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在HCC患者和LC患者中都無顯著性差異。此外，國(guó)內(nèi)哈明昊[16]報(bào)道，IL-28B rs12979860位點(diǎn)T等位基因在ASC人群、CHB患者和LC患者中無顯著性差異，可能不是病情進(jìn)展的影響因素，與本文研究結(jié)果是不一致的。本研究還發(fā)現(xiàn)IL-28B rs12979860位點(diǎn)在健康人群和LF患者中有顯著性差異，C等位基因的HBV攜帶者罹患LF的風(fēng)險(xiǎn)增加。是否與LF相關(guān)的報(bào)道較少，本研究的下一步將進(jìn)一步擴(kuò)大LF患病人群，研究LF發(fā)生發(fā)展的機(jī)理及其與遺傳基因的相關(guān)性問題。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-28B基因rs8099917位點(diǎn)在LC患者與健康人群有顯著性差異，即IL-28B rs8099917位點(diǎn)T等位基因的攜帶者罹患LC的風(fēng)險(xiǎn)增加。Kimkong et al報(bào)道[11]在臺(tái)灣地區(qū)，相對(duì)于健康人群組，IL-28B T等位基因都是乙型肝炎病程進(jìn)展的易感基因，T等位基因是CHB的易感基因，但不是LC和HCC的易感基因。Kim et al[17]報(bào)道，相對(duì)于正常人，攜帶T等位基因者罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)增加。哈明昊[16]報(bào)道，T等位基因在ASC人群、CHB患者和LC患者無顯著性差異。也有與之不一致的報(bào)道，比如Hodo et al[18]發(fā)現(xiàn)T等位基因是肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)基因，而Lee et al[14]報(bào)道該點(diǎn)在HCC患者和LC患者中都無顯著性差異。國(guó)內(nèi)王艷[19]報(bào)道IL-28B G是發(fā)生HCC的高風(fēng)險(xiǎn)基因，T則是保護(hù)性基因。這些在不同地區(qū)和不同人群研究結(jié)果的差異，提示IL-28B基因多態(tài)性導(dǎo)致乙型肝炎病情進(jìn)展仍存在較多的爭(zhēng)議。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)了人外周血IL-28B rs8099917和rs12979860基因多態(tài)性與HBV感染后的病情進(jìn)程有一定的關(guān)聯(lián)，且可能受到不同地區(qū)不同種族人群遺傳結(jié)構(gòu)的影響，以及研究對(duì)象樣本量的影響，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。