陳翰秋

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所,西藏 拉薩 850032）

小菜蛾（Plutella xylostella）適應(yīng)力強(qiáng)、傳播范圍廣、田間發(fā)生世代重疊，是一種嚴(yán)重危害十字花科作物產(chǎn)量與質(zhì)量的的世界性害蟲。廣譜殺蟲劑的長時間、高劑量的使用是造成其爆發(fā)增長的外在因素。在這種條件下小菜蛾對各種殺蟲劑抗藥性急劇上升，并且對多種藥劑產(chǎn)生了數(shù)千倍的抗性，給小菜蛾的長期防治帶來了前所未有的壓力［1-4］。球孢白僵菌（Beauve?ria bassiana）殺蟲范圍廣、致病力強(qiáng)、應(yīng)用簡便無污染，是目前生物防治中研究和應(yīng)用最為廣泛的昆蟲病原真菌［5-7］。結(jié)合生物防治綠色環(huán)保和和化學(xué)殺防治作用效果快的特點(diǎn)，防治時將兩種手段配合使用能大大提高防治效果，并且能減輕環(huán)境污染壓力［8-9］。本研究測定了9種球孢白僵菌株系和5種化學(xué)殺蟲劑對潼南地區(qū)小菜蛾幼蟲的毒力，并對球孢白僵菌與殺蟲劑混配相容性與毒力進(jìn)行解析，從而為小菜蛾綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。球孢白僵菌菌株由西南大學(xué)生物技術(shù)中心提供（表1）。

表1 球孢白僵菌株系信息

1.1.2 供試?yán)ハx。小菜蛾試驗(yàn)種群采集于重慶市潼南區(qū)太安鎮(zhèn)灌壩村國家級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技園，于室內(nèi)以甘藍(lán)和蘿卜苗連代飼養(yǎng)。小菜蛾敏感種群由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)吳益東教授提供。

1.1.3 主要藥劑。化學(xué)藥劑種類及來源見表2。

表2 化學(xué)藥劑信息

1.2 方法

1.2.1 球孢白僵菌孢懸液制備。球孢白僵菌接種于PDA培養(yǎng)基（成分:葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，自然pH）上，刮取生長12 d的球孢白僵菌孢子，溶解于0.05%吐溫-80無菌水中，渦旋振蕩器上振蕩均勻后用無菌紗布過濾。用血球計數(shù)板計數(shù)，用0.05%吐溫-80無菌水將孢子懸浮液釋至1×108個/mL，4℃條件下保存?zhèn)溆茫?0-11］。

1.2.2 對小菜蛾高毒的球孢白僵菌篩選及毒力測定。篩選試驗(yàn)中，使用浸液法先將每個株系配制成濃度1×107個/mL的懸浮液。再將大小一致健康的小菜蛾4齡初期幼蟲浸入孢子懸浮液5s后將幼蟲轉(zhuǎn)移至新鮮甘藍(lán)葉片上，置于9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，底部用雙層濾紙保濕。培養(yǎng)皿用保鮮膜封口后均勻扎孔，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（27±1°C，RH=65±5%，L:D=8:16）。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭。對照組幼蟲用0.05%吐溫-80無菌水處理，相同條件下培養(yǎng)。24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后取出，記錄死、活蟲數(shù)，用毛筆輕觸無反應(yīng)則認(rèn)為幼蟲死亡?？瞻讓φ盏乃劳雎试?0%以上，試驗(yàn)需重做。

白僵菌株系毒力測定試驗(yàn)中，將配制好的孢子懸浮母液用0.05%吐溫-80無菌水稀釋成1×107個/mL、0.75×107個/mL、0.5×107個/mL、0.25×107個/mL、0.05×107個/mL 5個濃度梯度。選取健康的小菜蛾3齡幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)，具體方法同篩選試驗(yàn)。

1.2.3 對小菜蛾高毒化學(xué)農(nóng)藥篩選及毒力測定。利用浸液法，藥劑用丙酮溶解后再用0.1%TritonX-100純凈水配成1000 mg/L母液備用。將葉片在不同質(zhì)量濃度的溶液中浸泡10 s后取出自然晾干，葉背面朝上鋪于培養(yǎng)皿上，將大小一致健康的小菜蛾3齡幼蟲挑至新藍(lán)葉片上，置于9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，底部用雙層濾紙保濕。培養(yǎng)皿用保鮮膜封口后均勻扎孔，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（27±1°C，RH=65±5%，L:D=8:16）。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭，以0.1%Tri?tonX-100純凈水為對照。試驗(yàn)后24h、48h、72 h分別觀察死亡情況，記錄死、活蟲數(shù)。空白對照的死亡率在20%以上，試驗(yàn)需重做。

1.2.4 殺蟲劑對球孢白僵菌菌株孢子萌發(fā)的影響。將篩選出的高效球孢白僵菌配制成濃度為106個/ml孢子懸浮液，用2.0%蔗糖溶液培養(yǎng)。孢子懸浮液中加入LC50濃度的化學(xué)藥劑。孢子懸液在25±1°C條件下振蕩（100 r/min）培養(yǎng)24 h，鏡檢孢子萌發(fā)率。每種藥劑3個重復(fù)，對照組不加藥劑。

1.2.5 球孢白僵菌與化學(xué)農(nóng)藥混用對小菜蛾毒力測定。將篩選出的對球孢白僵菌孢子萌發(fā)率抑制較低的化學(xué)殺蟲劑與球孢白僵菌孢子懸浮劑進(jìn)行混配，采用浸液法進(jìn)行毒力測定。球孢白僵菌孢子懸浮劑濃度為107個/ml,殺蟲劑濃度為該藥劑對小菜蛾3齡幼蟲的LC50濃度。球孢白僵菌孢子懸浮劑處理幼蟲方法同1.2.2，化學(xué)藥劑處理葉片方法同1.2.3。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理采用Excel、Spss 19.0軟件，計算出毒力回歸方程、LC50值、95%的置信限、抗性倍數(shù)（RR）。作圖采用Origin 9.0。小菜蛾的抗藥性分級標(biāo)準(zhǔn)參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2360-2013：抗性倍數(shù)（RR）＜10為低水平抗性，10≤RR＜100為中等水平抗性，RR≥100為高水平抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小菜蛾高致病力球孢白僵菌的篩選

圖1 真菌對小菜蛾幼蟲的累計校正死亡率

表3 不同菌株對小菜蛾幼蟲的毒力測定

通過分析不同菌株對小菜蛾幼蟲的毒力測定結(jié)果（表3），得出對小菜蛾致病力較高的球孢白僵菌品系為Bb0601、Bb0604、Bb07、Bb014、Bb252和Bb0603，其累計校正死亡率分別達(dá)到了85.19%、74.07%、70.37%、59.26%、59.26%.其中Bb0601品系效果最好（圖1），從第一天到第六天其死亡率在9中試驗(yàn)品系中都是最高。并對篩選出的6種效果較好的球孢白僵菌進(jìn)行毒力測定（表4）。

表4 不同菌株對3齡小菜蛾幼蟲毒力

通過毒力測定結(jié)果（表4）可以得出，球孢白僵菌Bb0601、Bb0604、Bb07、Bb252、Bb014和Bb0603致死濃度分別為 0.974×107個/ml、1.111×107個/ml、1.435×107個/ml、1.741×107個/ml、1.503×107個/ml和12.283×107個/ml。致死濃度越小說明該菌株致病力越強(qiáng)。

2.2 對小菜蛾高致病力化學(xué)藥劑的篩選

阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺、蟲酰肼、高效氯氰菊酯、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對3齡小菜蛾的LC50（表 5）分別為 250.52 mg/L、7.52mg/L、35.18 mg/L、335.30 mg/L、8.72 mg/L。小菜蛾潼南種群對這5種化學(xué)藥劑已產(chǎn)生不同程度的抗性。阿維菌素的抗性指數(shù)高達(dá)12526倍，為極高水平抗性；氯蟲苯甲酰胺、高效氯氰菊酯、甲維鹽的抗性指數(shù)分別為32.70倍、94.45倍、91.35倍，為中等水平抗性；蟲酰肼的抗性指數(shù)為0.65倍，為低水平抗性。說明重慶潼南地區(qū)對蟲酰肼和氯蟲苯甲酰胺的抗性水平處于較低水平。

2.3 球孢白僵菌與化學(xué)農(nóng)藥的混配

2.3.1 球孢白僵菌與殺蟲劑相容性試驗(yàn)。

表5 5種殺蟲劑對潼南小菜蛾種群和室內(nèi)敏感品系的毒力

表6 球孢白僵菌（Bb0601）與殺蟲劑相容性試驗(yàn)

圖2 不同藥劑中球孢白僵菌（Bb0601）的孢子萌發(fā)率

球孢白僵菌Bb0601孢子的萌發(fā)率在藥劑中的萌發(fā)率從低到高為高效氯氰菊酯、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺、蟲酰肼，其累計萌發(fā)率分別為27.02%、43.86%、46.21%、61.21%、77.38%.蟲酰肼和氯蟲苯甲酰胺對球孢白僵菌Bb0601孢子萌發(fā)率抑制作用最低。

表7 球孢白僵菌（Bb0601）和殺蟲劑混配毒力測定

圖3 氯蟲苯甲酰胺、蟲酰肼單劑和與球孢白僵菌（Bb0601）混劑的LC50

2.3.2 球孢白僵菌與化學(xué)農(nóng)藥混配毒力測定。將濃度為0.974×107個/ml的球孢白僵菌Bb0601品系分別與氯蟲苯甲酰胺和蟲酰肼混合后其LC50分別為22.60 mg/L、5.20mg/L。氯蟲苯甲酰胺和蟲酰肼單劑的LC50分別為35.178 mg/L、7.52 mg/L，混劑較單劑的LC50分別下降了35.76%、30.85%.可見球孢白僵菌與殺蟲劑混配后能夠有效減少農(nóng)藥的使用量。

3 結(jié)論與討論

隨著農(nóng)藥的亂用、濫用現(xiàn)象加劇，小菜蛾的抗藥性水平不斷提高。為了解決實(shí)際應(yīng)用中農(nóng)藥的殺蟲效果降低問題以及減小害蟲抗性壓力，生物防治手段的開發(fā)及生物制劑與化學(xué)制劑的混配是非常好的解決途徑。

針對潼南地區(qū)小菜蛾抗性水平，試驗(yàn)篩選出了對小菜蛾高效的球孢白僵菌株系和化學(xué)殺蟲劑，又通過對球孢白僵菌與殺蟲劑相容性試驗(yàn)篩選出對球孢白僵菌抑制作用較小的兩種殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺和蟲酰肼。結(jié)果表明球孢白僵菌和化學(xué)藥劑可以混配且效果良好，混配藥劑能在小菜蛾的防治中顯著減少化學(xué)藥劑的使用量。為重慶潼南地區(qū)利用球孢白僵菌和化學(xué)藥劑防治小菜蛾提供了理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。