謝楓才，張　賓，孫繼鵬

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361005)

0　引言

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)屬ω-3多不飽和脂肪酸，是人類(lèi)大腦及視網(wǎng)膜的重要成分。DHA具有調(diào)節(jié)人體內(nèi)脂蛋白、血脂正常代謝和降血壓作用，并能降低血液黏稠度和膽固醇水平，預(yù)防動(dòng)脈硬化[1-4]。大量研究表明，DHA缺乏會(huì)引起嬰幼兒或兒童腦部發(fā)育受阻，致使視力障礙及記憶力下降[5-6]。魚(yú)油中富含豐富的DHA，市場(chǎng)上的DHA 產(chǎn)品主要是從深海魚(yú)油中提取，但是魚(yú)油易受到環(huán)境、氣候等因素影響而發(fā)生劣變，目前其產(chǎn)量?jī)H能滿足世界需求量的60%左右[7]。

微藻在海洋中的角色為初級(jí)生產(chǎn)力，許多微藻能自身合成DHA，其DHA相對(duì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于魚(yú)油中DHA含量[8]。此外，藻油屬于食物鏈最低端，其不含海洋污染物和膽固醇，且較為純凈、腥味小及穩(wěn)定性好，產(chǎn)品回收率高于魚(yú)油[9-10]。研究表明，同等劑量不同來(lái)源的DHA 對(duì)兒童記憶力的影響具有相同作用[11]，因此，藻油作為DHA的重要來(lái)源一直備受關(guān)注。DHA可分為甲酯型、乙酯型、甘油酯型和游離型4類(lèi)。目前市場(chǎng)上DHA產(chǎn)品多為乙酯型，如美國(guó)FDA藥品數(shù)據(jù)庫(kù)收載的6個(gè)ω-3多不飽和脂肪酸[12]、美國(guó)藥典(USP35)和歐盟藥典(07/2012：1250)收載的ω-3多不飽和脂肪酸均為乙酯型。

對(duì)于魚(yú)油及藻油產(chǎn)品中DHA的檢測(cè)方法，目前主要采用氣相色譜法[13-14]，但由于DHA屬于長(zhǎng)鏈脂肪酸，不易氣化，所以檢測(cè)時(shí)需在較高溫度下進(jìn)行且分析時(shí)間較長(zhǎng)[15]。因此，為避免高溫對(duì)DHA穩(wěn)定性的影響，人們逐漸嘗試采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)作為DHA含量的檢測(cè)分析方法[16]。藻油中不飽和脂肪酸包含DHA和二十二碳五烯酸(docosahexaenoic acid，DPA)2類(lèi)，HPLC法較難將兩者進(jìn)行分離，會(huì)造成DHA測(cè)定結(jié)果偏高。因此，本文針對(duì)以上問(wèn)題，建立基于HPLC的藻油中DHA乙酯(docosahexaenoic acid ethyl ester,DHA-EE)的分析方法，在優(yōu)化檢測(cè)參數(shù)基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)建立方法的精密度和準(zhǔn)確度，旨在實(shí)現(xiàn)藻油樣品中乙酯型DHA含量的高效快速定量分析。

1　實(shí)驗(yàn)方法

1.1　儀器和試劑

LC-1260型高效液相色譜儀、GC7890B氣相色譜儀器、紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Milli-Q型超純水儀，密理博中國(guó)有限公司；ME104E型分析天平，德國(guó)梅特勒公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海予華儀器設(shè)備公司。

乙酯型DHA標(biāo)準(zhǔn)品(DHA-EE，純度>99.6%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酯型DPA標(biāo)準(zhǔn)品(DPA-EE，純度>99.6%)，美國(guó)Nu-Chek公司；甲醇、正己烷(色譜純)，德國(guó)Merck公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；國(guó)內(nèi)某品牌藻油待測(cè)樣品。

1.2　色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C8(4.6 mm×250 mm)、SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm)、InertSustainSwift C18(4.6 mm×250 mm)；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=80∶20，85∶15 ，90∶10；流速分別為0.5，0.8，1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm。

1.3　標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取38.4 mg DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL 容量瓶中，甲醇定容搖勻后，采用HPLC法進(jìn)行分析檢測(cè)。準(zhǔn)確稱(chēng)取37.3 mg DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，正己烷定容搖勻后，采用HPLC法檢測(cè)。將DPA-EE標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，甲醇定容搖勻，采用HPLC法進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.4　藻油樣品制備

在250 mL三頸燒瓶中放入藻油樣品10 g，恒溫水浴升溫至55 ℃后，將含有0.016 g NaOH的無(wú)水乙醇(30 mL)加入三頸燒瓶中，密閉容器在恒溫水浴磁力攪拌反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸發(fā)將乙醇去除。準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)乙酯化藻油樣品1.0 g于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后用于HPLC分析。

2　結(jié)果

2.1　色譜柱的選擇

在相同色譜條件下，DHA-EE與DPA-EE在ZORBAX SB-C8、Inert Sustain Swift C18、SHIMADZU C18色譜柱上分離及出峰情況，如圖1所示。綜合考慮DHA-EE與DPA-EE的分離度、保留時(shí)間和峰形等色譜因素，發(fā)現(xiàn)二者在 ZORBAX SB-C8色譜柱上的保留時(shí)間相對(duì)較短，色譜峰形較為對(duì)稱(chēng)，且DPA-EE與DHA-EE分離度為11.44，分離效果良好。因此，選用ZORBAX SB-C8色譜柱進(jìn)行后續(xù)的DHA-EE與DPA-EE定量檢測(cè)分析。

2.2　分離條件的選擇

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

考察不同波長(zhǎng)對(duì)DHA-EE和DPA-EE分離效果、DHA-EE含量的影響，對(duì)藻油進(jìn)行100～800 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)波長(zhǎng)為204 nm時(shí)，DHA-EE分離峰可與DPA-EE及其他雜峰達(dá)到基線分離，可滿足分析檢測(cè)要求。DHA-EE最大吸收峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)204 nm處。綜合考慮色譜分離效果及DHA-EE吸收值，選擇波長(zhǎng)204 nm進(jìn)行后面的分析。

2.2.2流動(dòng)相的選擇

考察甲醇與水的不同配比(V∶V)對(duì)DHA-EE和DPA-EE分離效果影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)V(甲醇)∶V(水)=90∶10時(shí)，DHA-EE分離峰可與DPA-EE及其他雜峰達(dá)到基線分離，可滿足分析檢測(cè)要求。該流動(dòng)相條件下，其分離運(yùn)行時(shí)間顯著優(yōu)于V(甲醇)∶V(水)=80∶20和V(甲醇)∶V(水)=85∶15這兩個(gè)比例的，從而可提高實(shí)驗(yàn)的分析效率。綜合考慮色譜分離時(shí)間及效果，選擇V(甲醇)∶V(水)=90∶10作為流動(dòng)相進(jìn)行后面的分析。

2.2.3流速的選擇

在確定流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=90∶10條件下，考察不同流速(0.5，0.8，1.0 mL/min )對(duì)DHA-EE和DPA-EE分離效果影響，結(jié)果如圖4所示。綜合考慮DHA-EE和DPA-EE分離度、保留時(shí)間、色譜峰峰形及其他雜質(zhì)峰等因素，選擇流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，獲得的DHA-EE和DPA-EE保留時(shí)間較為合理，且色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)。

綜上，DHA-EE與DPA-EE 的HPLC分析采用ZORBAX SB-C8(4.6 mm×250 mm)色譜柱，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm，柱溫為30 ℃。

2.3　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取不同濃度的DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣HPLC檢測(cè)，測(cè)定分離峰的面積響應(yīng)值，建立DHA-EE回歸方程為：y=39.91x+765.11(R2=0.999 2)，在0.008 1～1.92 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，進(jìn)而繪制峰面積-濃度之間的相關(guān)關(guān)系，如圖5所示。

2.4　精密度分析

取一定濃度的DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣10次進(jìn)行HPLC分析，通過(guò)分離峰面積響應(yīng)值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為RSD=0.1%，表明儀器精密度良好(見(jiàn)表1)。

表1　儀器精密度試驗(yàn)

2.5　穩(wěn)定性分析

取DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別放置0，2，4，6，8，10，12，16，20，24 h后進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)峰面積響應(yīng)值來(lái)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，獲得DHA-EE的RSD為0.25%，表明樣品在24 h內(nèi)DHA-EE穩(wěn)定性良好(見(jiàn)表2)。

表2　DHA-EE穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6　定量限分析

根據(jù)儀器信噪比(S/N)小于3 為標(biāo)準(zhǔn)，DHA-EE最低定量限為7.10 ng，儀器信噪比(S/N)大于10 為標(biāo)準(zhǔn)，DHA-EE最低定量限為8.05 ng。

2.7　加標(biāo)回收率測(cè)定

取不同含量的藻油樣品5份，加入一定量的DHA-EE，做加標(biāo)回收，結(jié)果表明，DHA-EE加標(biāo)回收率平均值為102.42%，RSD為2.25%，表明加樣回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.8　待測(cè)樣品分析

取3份乙酯化后藻油樣品，按照上述優(yōu)化后方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)；另外取3份相同樣品，進(jìn)行氣相色譜(gas chromatography,GC)檢測(cè)，進(jìn)行對(duì)比分析。GC檢測(cè)條件：進(jìn)樣口溫度為270 ℃，總流量為30 mL/min，柱流量為1 mL/min、分流比為10∶1，色譜柱為SP-2560，檢測(cè)器溫度280 ℃。HPLC法對(duì)藻油中DPA-EE與DHA-EE分離效果如圖6所示，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，2種方法測(cè)得DHA-EE含量相差不大，且都能保持穩(wěn)定，均可作為藻油中DHA-EE含量測(cè)定方法。但從分析效率來(lái)看，HPLC法保留時(shí)間與GC法對(duì)比，顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。因此，高效液相色譜法更優(yōu)于氣相色譜法。

表3　DHA-EE回收率測(cè)定

表4　藻油樣品中DHA-EE含量

編號(hào)NumberGC質(zhì)量分?jǐn)?shù)Content/%保留時(shí)間Retentiontime/minHPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)Content/%保留時(shí)間Retentiontime/min155.8560.0754.4510.55255.8560.0654.5810.52355.5560.1154.5210.61平均Average55.6060.0854.5210.54

3　討論

目前，對(duì)DHA-EE含量的分析主要采用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，氣相色譜法存在一定的技術(shù)問(wèn)題，如長(zhǎng)鏈碳的脂肪不易氣化、保留時(shí)間長(zhǎng)[9]。此外，采用氣相色譜法對(duì)DHA-EE含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，DHA-EE線性回歸方程y=1 503x-26.275，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，在14.52～746.00 ng范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。但氣相色譜法一般采用分流進(jìn)樣，要獲得較好的峰形，需設(shè)置較大的分流比，同時(shí)還要相應(yīng)增加樣品溶液的濃度。本文中，采用高效液相色譜法對(duì)海洋微藻油中DHA-EE含量測(cè)定，建立DHA-EE回歸方程為y=39.91x+765.11(R2=0.008 1)，其在0.008 1～1.92 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，且對(duì)藻油中DHA-EE與DPA-EE分離效果良好，相比氣相色譜法更為快速、簡(jiǎn)便可行。

4　結(jié)論

本文以藻油中乙酯型DHA為分析對(duì)象，建立了基于HPLC的藻油中DHA-EE分離檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，當(dāng)采用ZORBAX SB-C8色譜柱，流動(dòng)相以V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm，柱溫為30 ℃和進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，DHA-EE在0.008 1～1.92 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，測(cè)定平均回收率為102.42%(n=5，RSD=2.25%)，精密度良好(n=10，RSD=0.32%)，DHA-EE最低定量限可達(dá)8.05 ng。建立的DHA-EE分析方法，表現(xiàn)出較好的精密度及穩(wěn)定性，其待測(cè)樣品耗量少且成本較低，可用于藻油及其制品中DHA-EE含量的測(cè)定，該方法也可以應(yīng)用于目前乙酯型DHA產(chǎn)品的定量檢測(cè)。