申屠旭萍,姚佳憶,俞曉平

(中國計量大學 生命科學學院,浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018)

基因組重排技術(shù)這一概念的首次提出是在2002年Nature上發(fā)表的一篇文章,這篇文章的作者Zhang等一直致力于通過DNA重組和定向進化來改良菌株[1].DNA重組是一種通過隨機片段和聚合酶鏈式反應(yīng)在體外對選定的突變基因進行體外同源重組的方法[2-4].通過DNA重組,成功地完成了多個基因和通路的分子定向進化[5-8].基因組重排技術(shù)是在DNA重組基礎(chǔ)上結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù),通過多親本之間的DNA重組和全基因組片段交換,將多個優(yōu)良表型重組在一起的過程[1].它被認為是對菌株表型改良的組合方法的應(yīng)用,并被譽為菌株選育和代謝工程的一個重要里程碑[9].

1　基因組重排的概述

微生物的育種方式多種多樣,從傳統(tǒng)菌株育種技術(shù)到分子改造技術(shù),現(xiàn)在人們可以更加理性地對微生物進行改造從而獲得目的菌株[10-12].野生型菌株的產(chǎn)物產(chǎn)量往往較低,因此需要通過人工或者實驗室手段對其進行改造.基于序列隨機突變和篩選的傳統(tǒng)菌株育種技術(shù)是提高工業(yè)微生物產(chǎn)量的主要方法,因為這種方法無需了解菌株的遺傳信息,也無需進行遺傳操作[13].人們通過連續(xù)的誘變和篩選獲得目的菌株,然而這個過程十分漫長,而且突變頻率低,耗時耗力,1年可能僅僅只提高菌株10%的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[14],更有可能會造成菌株的回復(fù)突變.由于對大部分菌株的遺傳信息缺乏了解,使得傳統(tǒng)的育種技術(shù)存在很大的局限性.

相較于傳統(tǒng)菌株育種技術(shù),基因組重排具有非常明顯的優(yōu)勢.基因組重排技術(shù)突破了傳統(tǒng)菌株育種技術(shù)的局限性,它是一種基于原生質(zhì)體遞歸融合的新型分子育種技術(shù),是分子定向進化在全基因組水平上的延伸[1,9].相較于傳統(tǒng)菌株育種技術(shù),基因組重排更為省時省力,兩輪重排就能達到20年的經(jīng)典育種效果[1].而且大部分的育種技術(shù)為了獲得目的表型,通常基因突變來源較為單一，而基因組重排技術(shù)則由于多親本之間的遞歸融合,有較多的基因來源,能使許多正向突變的表型聚集在一起.

2　基因組重排的過程

基因組重排的過程分為:1)親本菌株的選擇;2)親本菌株原生質(zhì)體制備與融合;3)融合子的篩選(圖1).因此,它的成功取決于親本菌株的選擇,及原生質(zhì)體融合重組的效率以及篩選的方法.

圖1　基因組重排的過程Figure 1　Process of genome shuffling

2.1　親本菌株的選擇

基因組重排的第一步就是獲取一個基因多樣化的親本庫.隨著進化工程的發(fā)展,菌株的多樣性分布也隨之發(fā)生變化.重組使基因產(chǎn)生了新的排列,從而增加了菌種的遺傳多樣性.

我們所需的表型有時能在自然界中找到,但不一定存在于目的菌株.這些理想表型可能存在于目的菌株的同源菌株或者突變株中,而這些菌株就可以作為具有優(yōu)良表型的親本菌株,進行基因組重排.突變存在于整個基因組[14-15],不同的突變方式會產(chǎn)生不同的突變體,導致每個突變體具有特異性,從而增加了突變體的多樣性[16-17],因此這些不同類型的突變體可以作為具有優(yōu)良表型的親本菌株.在基因組重排實驗中,化學或物理誘變常被用于誘導產(chǎn)生不同類型的突變株,從而使親本菌株具有遺傳多樣性.

Li等用五株鏈霉菌包括稠李鏈霉菌(Streptomycespadanus)、灰褐鏈霉菌(Streptomycesgriseofuscus)、禾粟鏈霉菌(Streptomycesgraminearus)、吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)分別用紫外誘變和亞硝基胍(NTG)誘變作為多樣性來源,得到最佳突變株后進行重組,以期進一步提高聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine)的產(chǎn)量[18].

最近,通過核糖體工程選育獲得的自發(fā)突變菌株增加了菌株的遺傳多樣性,同時也為基因組重排提供了優(yōu)良的親本.Wang等在對活躍鏈霉菌(Streptomycesactuosus)親本菌株改良時,發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S12發(fā)生了突變,且突變位點存在多樣性.其中大多數(shù)有效突變發(fā)生在K88R,而在S12蛋白的N端還存在其它的突變,主要檢測到的有Q6N(C,L)、Q5I(L,P)和I4T(F)等突變[19].因此,核糖體工程可以作為基因組重排中親本菌株獲得的有效方法.

2.2　原生質(zhì)體融合

實現(xiàn)菌株基因重組最常見的方法就是原生質(zhì)體融合.對于基因組重排來說,可以通過多種菌株的原生質(zhì)體融合獲得新的重組子.原生質(zhì)體融合的具體過程包括利用酶將菌株細胞壁去除獲得原生質(zhì)體,然后利用電融合或者聚乙二醇(polyethylene glycol,簡稱PEG)等方法進行融合,隨后進行復(fù)壁,并對獲得的融合菌株進行篩選.原生質(zhì)體最重要的一個優(yōu)點在于它能將不同類型的菌株融合到一起,理論上講,任何原生質(zhì)體都可以融合到一個融合子中[20].盡管融合的效率很低,但實踐證明,一輪的原生質(zhì)體融合可成功地將擁有四個不同營養(yǎng)缺陷型標記的天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)融合到一株菌株中.這意味著多個突變體之間的重組可以同時發(fā)生,從而通過產(chǎn)生更多的組合和排列來加速進化過程.經(jīng)過四輪遞歸融合后,統(tǒng)計每輪增加的重組比例,結(jié)果表明攜帶兩個標記的菌株從第一輪的8.4%提高到第四輪60%,而攜帶三個和四個標記的菌株分別從0.73%增加到17%和從0.000 05%到2.5%[1].

Hopwood提出了利用紫外線輻射等方法將原生質(zhì)體滅活后進行融合,能有效提高原生質(zhì)體的融合效率[20].因為失去了細胞壁的原生質(zhì)體,在滅活過程中染色體更容易被損傷.理論上,對于同種親本菌株的原生質(zhì)體使用相同的方法滅活,易導致親本菌株因染色體損傷部位相同無法互補而難再生.但利用不同方法滅活,就可以使親本菌株因染色體不同部位的損傷可以得到互補,從而能有效獲得融合菌株[21].

2.3　融合子的篩選

將遞歸原生質(zhì)體融合后得到的融合子進行篩選獲得所需表型,是確保整個基因組重排過程成功的關(guān)鍵一步.盡管獲得遺傳多樣性的方法有很多,但篩選的方法仍有待開發(fā).

通過選擇培養(yǎng)基或者改變培養(yǎng)條件可以篩選出耐受性改良菌株,但長期以來,代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)一直被認為是一種難以獲得的表型.利用經(jīng)典的生理生化性狀的方法可以獲得部分高產(chǎn)菌株,如利用菌株的代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解區(qū)、透明區(qū)、抑菌區(qū)等對高產(chǎn)菌株進行篩選.例如,利用clear zone方法來篩選能夠直接分解淀粉生產(chǎn)L-乳酸的高產(chǎn)菌株[22].該菌株首先在含CaCO3的培養(yǎng)基上進行篩選,能產(chǎn)生乳酸的菌株可在培養(yǎng)基上產(chǎn)生清晰的區(qū)域.然后對篩選得到的菌株進行淀粉酶的測試,可以在CaCO3和淀粉-碘板中產(chǎn)生清晰區(qū)域的菌株被確定為理想的菌株.然而大部分活性次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高不能通過表型的方法來篩選.

Dai等利用營養(yǎng)缺陷性菌株對革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)進行基因組重排[23].但是,營養(yǎng)缺陷的遺傳標記會影響到菌株的生理和代謝,產(chǎn)生“先天不足”的后代,從而降低了生理性能.因此,在基因組重排的過程中,應(yīng)進一步發(fā)展高效的篩選方法.Zhang等利用滅活親本原生質(zhì)體的方法對樹狀多節(jié)孢(Nodulisporiumsylviform)進行融合重組,發(fā)現(xiàn)多親本原生質(zhì)體的失活可以避免遺傳標記的眾多過程,從而提高了重組的篩選效率[20].

最近,一些較為新穎的篩選方案應(yīng)用于獲得所需的菌株.例如,在培養(yǎng)基中添加菌株產(chǎn)物類似物,能有效分離得到高產(chǎn)菌株.Hid等利用一種類似于羥基檸檬酸(HCA)的抗生素反式環(huán)氧丙烯酸(EAA),篩選HCA高產(chǎn)菌株[24].EAA抑制了非融合原生質(zhì)體的再生,從而篩選獲得融合后的重組菌株.有人將核糖體工程和基因組重排結(jié)合在一起,利用菌株的抗藥性來獲得高產(chǎn)菌株.Zheng等利用博來霉素作為抗性標記,對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)進行基因組重排,篩選得到目的菌株,其生產(chǎn)乙醇的能力和對乙酸的耐受性都有顯著的提高[25].Wang將基因組重排和核糖體工程結(jié)合起來,對活躍鏈霉菌(S.actuosus)進行改造,重組菌株對鏈霉素的抗性從20 μg/mL到500 μg/mL,其產(chǎn)物諾西肽(Nosiheptide)產(chǎn)量提高了9.2倍[19].

3　基因組重排的應(yīng)用

基因組重排近幾年被證明是一種有效進化細胞工程的方法,用來快速改良微生物表型.基因組重排不僅可以提高菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)率,還可以提供菌株復(fù)雜的代謝和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的信息和數(shù)據(jù)的來源[26].

3.1　提高菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)量

微生物是許多生物制品的來源,包括抗生素、抗腫瘤化合物、免疫抑制劑、抗病毒、抗蟲藥等.大多數(shù)微生物都具有復(fù)雜的表型,它依賴于遺傳水平上的多重調(diào)控,許多都需要涉及多個基因的操作,特別是在次生代謝產(chǎn)物的合成中.基因組重排技術(shù)被證明是能融合復(fù)雜表型的方法.

近幾年,基因組重排技術(shù)成功改良微生物,使菌株產(chǎn)活性物質(zhì)的能力快速提高.由刺糖多孢菌(Saccharopolysporapinosa)產(chǎn)生的多殺菌素是一種非常有前景的抗蟲藥物,廣泛地使用在谷物儲存,以及蔬菜、水果、觀賞植物等的病蟲害防治上,且具有低毒、低殘留、對昆蟲天敵安全、自然分解快的優(yōu)點[27].然而,多殺菌素的開發(fā)受到了刺糖多孢菌產(chǎn)素水平低的嚴重限制.Wang等利用基因組重排技術(shù),提高多殺菌素的產(chǎn)量.與原始菌株相比,融合子多殺菌素的產(chǎn)量增加了約3.7倍[28].

達托霉素是玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)生產(chǎn)的一種抗生素,一般用于治療由革蘭氏病原體引起的皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染[29].Yu等人利用基因組重排技術(shù),經(jīng)過四輪融合,成功地將達托霉素的產(chǎn)量提高了4.8倍[30].

3,7,15-Trihydroxy-5-androsten-17-one(7,15-diOH-DHEA)是新型口服避孕藥優(yōu)思明(Yasmin)的關(guān)鍵中間體,通過亞麻刺盤孢菌(Colletotrichumlini)催化脫氫表雄酮(DHEA)獲得.Sun等人通過3輪基因組重排,使C.lini催化DHEA獲得7,15-diOH-DHEA能力提高了97.8%[31].

3.2　提高菌株對環(huán)境的耐受性

環(huán)境耐受性是一種較為復(fù)雜的表型,這些特性包括菌株對產(chǎn)品、基質(zhì)、副產(chǎn)品以及溫度、pH等環(huán)境因素的耐受性.大部分菌株的耐受性是受基因調(diào)控,并與其它基因相互作用.因此,對這些耐受表型進行合理的代謝工程改造成為一項艱巨的任務(wù).而基因組重排在改良菌株耐受性方面較有優(yōu)勢.

乳酸在食品和制藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛,因此乳酸產(chǎn)生菌發(fā)酵水平越高越好,目的產(chǎn)物濃度高,下游工序成本就降低.然而,乳酸的產(chǎn)生會受到底物葡萄糖的抑制,因此有必要在乳酸發(fā)酵過程中提高糖耐受度.Yu等應(yīng)用基因組重排提高鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)對葡萄糖的耐受性,同時提高了乳酸的產(chǎn)量.第二輪基因組重排之后篩選獲得的菌株其乳酸產(chǎn)量、細胞生長和葡萄糖消耗分別高于野生型71.4%、44.9%和62.2%[32].

醇類物質(zhì)作為新型能源廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中.然而異丙醇、丁醇和乙醇(IBE)對于IBE生產(chǎn)菌拜式梭菌(ClostridiumbeijerinckiiDSM 6423)的生長具有很強的抑制作用.Gérando對拜式梭菌進行NTG化學誘變獲得親本菌株后進行多輪基因組重排,得到了一株能承受高達50 g/L異丙醇的重組菌株,較原始菌株提高了49%[33].

木質(zhì)纖維素水解與乙醇同步發(fā)酵能獲得新型燃料纖維乙醇,然而在木質(zhì)素水解過程中,許多副產(chǎn)物如羥甲基糠醛等對發(fā)酵菌株釀酒酵母(S.cerevisiae)的生長和代謝具有抑制作用.Cheng等利用4輪基因組重排,使釀酒酵母對木質(zhì)素水解副產(chǎn)物5-羥甲基糠醛(5-(hydroxymethyl)-furfural, HMF)的耐受性提高了1倍,大大的提高了菌株的發(fā)酵水平[34].

3.3　合成新化合物

重組子為親本基因組隨機重組的嵌合體,兩類原本不在同一個生命體中同時出現(xiàn)的基因,經(jīng)過隨機重組結(jié)合到一起,在某種環(huán)境下由于某種特殊的機制產(chǎn)生某種未知的新物質(zhì)[35].

Wang等從紅豆杉中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Tuberculariasp. TF5,然而在實驗室長期培養(yǎng)過程中逐漸失去了合成紫杉醇的能力,嘗試通過基因組重排使菌株重新具有合成紫杉醇的能力.可是經(jīng)過基因組重排后,并未獲得紫杉醇,而是獲得了5種新的倍半萜類化合物,2種新的二氫異香豆素(dihydroisocoumarins)和1種新的四氫萘酮(tetralone)[36].

3.4　提高底物的利用率

菌株有效利用底物的能力也是一種理想的表型.通過基因組重排的方法,也可以獲得改良底物利用能力的菌株.

五氯酚(PCP)是一種劇毒的農(nóng)藥,解氯芬鞘氨醇桿菌(Sphingobiumchlorophenolicum)能降解PCP.然而,解氯芬鞘氨醇桿菌并不耐受高濃度的PCP. Dai等利用基因組重排提高解氯芬鞘氨醇桿菌對PCP的分解能力[34].對獲得的融合菌株分析表明,該菌株的生長速率大大加快,同時和降解PCP相關(guān)的基因的表達水平顯著提高,對PCP及其代謝物毒性的耐受性也明顯增強[37].

多環(huán)芳香烴(PAHs)是假單胞菌(Pseudomonassp. DHT)的底物,但是PAH的降解速度很慢.Kumar等人采用基因組重排技術(shù),提高菌株DHT對PAHs的降解能力.基因重排后獲得的菌株在液體培養(yǎng)基中降解多環(huán)芳烴的能力顯著提高[38].

3.5　增加遺傳多樣性

除了改良工業(yè)菌株,基因組重排方法還可以增加我們對代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控的認識.基因組重排的過程中,可以完成多種初始菌株的遺傳性狀重組,從而增加了菌株的遺傳多樣性.基因組重排實驗中菌株進化產(chǎn)生的表型很可能改變了代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)或者運輸機制.最近,Lv等用擴增片段長度多態(tài)性分析了基因組重排得到的綠產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes),發(fā)現(xiàn)其種群的遺傳特征發(fā)生了變化,其獨特的多態(tài)性條帶可能與卑霉素的產(chǎn)量增加有關(guān)[39].聚類分析進一步表明,與卑霉素生產(chǎn)能力相似的重組體具有類似的基因組變異.因此,通過對菌株表型工程的分析可以獲得代謝變化相關(guān)的遺傳變異信息.

Wang等利用基因組重排改良了小白鏈霉菌(S.albulus),對其進行AFLP分析,結(jié)果表明在初始菌株W-156、突變體A-79和重組體AG1-188和AG 3-28中,平均多態(tài)性的發(fā)生率分別為1.0%、2.1%、6.4%和10.8%[40].因此,在基因組重排過程中,重組體的多態(tài)性明顯增加,這意味著基因組重排引起的基因組變異更豐富.

4　展　望

基因組重排是對整個生物體和復(fù)雜表型進行定向進化的有力方法.它需要有遺傳多樣性的來源,經(jīng)過自然選擇或者人工誘變獲得突變菌株,然后利用遞歸原生質(zhì)體融合以及有效地篩選得到重組子.這種技術(shù)能允許基因組中不同位點的基因同時重組,因此多個基因的交換和重組可以快速而有效地發(fā)生,從而產(chǎn)生大量突變株,然后可以對所需的表型進行篩選[41].

與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比,基因組重排技術(shù)在改良菌株中省時省力,并且更為高效等獨特優(yōu)點[1].但迄今為止,基因組重排過程中目的融合子的篩選方法是目前限制這一技術(shù)應(yīng)用的瓶頸,尤其是重組片段大多來源隨機,高效篩選獲得目的菌株較為困難.已有文獻提出利用高通量篩選的方法,能對大量的融合子進行簡單、快速的篩選,但是高通量篩選這一方法距離廣泛應(yīng)用還有很遠距離[42].因此,菌株快速篩選的方法依舊需要不斷地改進與完善.

現(xiàn)今的育種研究中,可將基因組重排技術(shù)與代謝工程結(jié)合使用獲得具有優(yōu)良表型的目的菌株.例如先通過代謝工程提高菌株次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,然后和基因組重排技術(shù)相結(jié)合,再對突變菌株進一步優(yōu)化,從而獲得優(yōu)良的目的菌株;也有學者利用基因組重排首先獲得具有理想表型的菌株,然后利用發(fā)酵工程對菌株進一步優(yōu)化獲得目的菌株[26].因此,在今后的研究中可將基因組重排技術(shù)與生物工程上的多種技術(shù)相結(jié)合使用[43],為生物產(chǎn)業(yè)提供更多的所需的目的改良菌株,讓這項技術(shù)能夠得到更廣泛的應(yīng)用.