李雨欣 許筱穎 郭霞珍 施娜

摘要 目的：觀察松果體摘除術金黃地鼠白介素-1（Interleukin-1，IL-1）、IL-2、IL-6及IgE、IgG在四季中的水平并與正常金黃地鼠進行比較，探討松果體對免疫系統(tǒng)的季節(jié)性調控機制，揭示“腎應冬”的內涵。方法：選取2個月齡金黃地鼠，分為春分、夏至、秋分、冬至4個節(jié)氣組，每個節(jié)氣組內又分實驗組（行松果體摘除術）、對照組。動物飼養(yǎng)至春分、夏至、秋分、冬至4個時間點當日，于晚9：00后腹主動脈取血，用酶聯免疫吸附試驗測定相關免疫指標。結果：IL-2、IL-6、IgE、IgG的水平變化具有明顯的季節(jié)節(jié)律性；IL-1、IL-2、IL-6、IgG水平在冬季達到最低；實驗組和對照組間比較，顯示松果體能調控IL-2、IgE、IgG的分泌，IL-2在被摘除松果體后失去了季節(jié)變化的規(guī)律性。結論：血清白介素和免疫球蛋白水平基本存在春夏高、秋冬低的季節(jié)性變化規(guī)律，這與中醫(yī)“冬季封藏”的理論不謀而合，且松果體在此過程中對免疫系統(tǒng)發(fā)揮部分調節(jié)作用。

關鍵詞 腎應冬；二分二至；季節(jié)變化；金黃地鼠；免疫系統(tǒng)；白介素；免疫球蛋白；松果體

Abstract Objective：To discuss the effect of the pineal in modulating the immune system and the connotation of “kidney corresponds with winter” through observing the level of golden hamster′s interleukin-1 （IL-1），IL-2，IL-6 and IgE and IgG in seasons after removing the pineal and comparing it with normal golden hamsters.Methods：Two-month-old Golden hamsters were divided into four groups：vernal equinox，summer solstice，autumn equinox and winter solstice.Each group was subdivided into experimental group （row pineal extirpation） and control group.Golden hamsters were fed until vernal equinox，summer solstice，autumnal equinox and winter solstice.Blood was drawn from abdominal aorta on these four days after 9：00 pm，and ELISA method was used to measure the relevant immune index.Results：The content of IL-2，IL-6，IgE and IgG had obvious seasonal rhythmicity.The content of IL-1，IL-2，IL-6 and IgG reached the lowest in winter.It was shown that the pineal could regulate the secretion of IL-2，IgE and IgG，and IL-2 lost the regularity of seasonal change after removing the pineal.Conclusion：The content of serum interleukin and immune globulin basically is high in spring and summer and low in autumn and winter，which coincides with the theory of “winter-storing” in traditional Chinese medicine.And the pineal can partly regulate the immune system.

Key Words Kidney corresponds with winter； Equinoxes and solstices； Seasonal change； Golden hamster； Immune system； Interleukin； Immune globulin； Pineal gland

中圖分類號：R229文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.038

天人相應理論，是中醫(yī)學認識生命活動的特有思維模式，其中包涵著豐富的醫(yī)學氣象學理論思想[1]。天人相應理論認為，人體的生理、病理等生命活動，與自然環(huán)境的變化息息相關，人作為自然界的一分子，必須要順應自然界的四季和晝夜變化。自然界存在著人體賴以生存的必要條件，其變化對人體產生廣泛的影響，而機體也相應地產生反應去適應自然的變化規(guī)律，可見人體在形體結構、生理功能和病理變化方面都與自然界存在著密不可分的關系[2]。前期研究結果表明，“腎應冬”的調控機制與神經-內分泌-免疫網絡系統(tǒng)密切相關。本研究以免疫防御功能為切入點，通過動物實驗，研究腎與冬氣相通的免疫學物質基礎，為“腎應冬”的調控理論提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 金黃地鼠，雄性，2個月齡，體重（130±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，品系：LVG，級別：SPF，飼料為普通鼠全價顆粒飼料（北京維通利華公司提供）。

1.1.2 藥物 本實驗無藥物干預。

1.1.3 試劑與儀器 酶標儀：（Thermo Multiskan MK3，芬蘭）；生化儀：（Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron，美國）；孵育箱（泰斯特）；電熱恒溫鼓風箱（101-1AB型，中國）；洗板機（SUNOSTIK SAR-520B，中國）；離心機：（Beckman低溫高速離心機，美國）；IL-1、IL-2、IL-6、IgE、IgG酶聯免疫檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組：分為春分、夏至、秋分、冬至4個節(jié)氣，每個節(jié)氣前7周購入動物，隨機分為實驗組、對照組，每組8只，適應性飼養(yǎng)3 d，于春分、夏至、秋分、冬至前30 d進行造模。

模型制備：實驗組：10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射進行麻醉，固定于鼠板，乙醇消毒備皮，頭頂皮膚切口約1.5 cm，暴露顱矢狀縫、人字縫，以顱骨人字縫和矢狀竇中心為原點，用直徑約為0.5 cm特制電鉆鉆開頭骨，暴露矢靜脈（SSV）、橫向靜脈竇（T）、竇匯（CS）。沿SSV兩側縱向切開硬腦膜，雙結扎SSV，剪斷，向后翻轉斷端（近CS端），用眼科鑷取出松果體，把SSV放回原位，明膠海綿止血，用生理鹽水清創(chuàng)后縫合皮膚，傷口點適量青霉素溶液。手術后單籠飼養(yǎng)，1周左右觀察傷口情況，愈合情況良好則合籠。對照組：不做任何處理。氣候條件：選擇自然條件下春分、夏至、秋分、冬至4個時間點，恒溫飼養(yǎng)，春分、秋分動物房內溫度控制在（20±2）℃，夏至為（22±2）℃，冬至為（17±2）℃。自然光照，自由攝食進水。

取材：動物飼養(yǎng)至春分、夏至、秋分、冬至4個時間點，當日晚9：00后進行取材實驗。動物稱重后在暗室5周紅光燈下，麻醉后腹主動脈取血，靜置20 min后置于4 ℃離心機取血清（3 000 r/min，20 min），存于-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.2.2 給藥方法 無需給藥。

1.2.3 檢測指標與方法 用ELISA法測定血清中IL-1、IL-2、IL-6及IgE、IgG的水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，數據采用均數±標準差（±s）表示，實驗組、對照組間的數據比較采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布的數據采用非參數檢驗；春分、夏至、秋分、冬至4個時間段比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，非正態(tài)分布的數據采用非參數檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組不同季節(jié)環(huán)境下金黃地鼠血清IL-1水平比較

四季對照組與實驗組金黃地鼠血清IL-1季節(jié)性水平變化，對照組四季間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），各季節(jié)IL-1水平秋>春>夏>冬；實驗組春分IL-1水平與對照組春分相比升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），四季IL-1水平春>夏>秋>冬，春顯著高于其他3季（P<0.05）。無論是實驗組還是對照組，IL-1水平均在冬至達到最低值，表明IL-1在冬季水平最低，這與“冬主封藏”的規(guī)律相一致。見表1。

2.2 2組不同季節(jié)環(huán)境下金黃地鼠血清IL-2水平比較

四季對照組與實驗組金黃地鼠血清IL-2季節(jié)性水平變化，對照組IL-2水平夏至組顯著高于春、冬，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在冬至最低，整體水平夏>秋>春>冬；實驗組則這種季節(jié)之間的差異消失，各季節(jié)間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。生理條件下，IL-2水平變化有明顯的季節(jié)節(jié)律性，呈現夏高冬低的趨勢，符合“腎應冬”理論，而實驗組在摘除松果體后，這種季節(jié)節(jié)律性消失。見表2。

2.3 2組不同季節(jié)環(huán)境下金黃地鼠血清IL-6水平比較

四季對照組與實驗組金黃地鼠血清IL-6季節(jié)性水平變化，實驗組和對照組在春分的IL-6水平均顯著高于同組其他3季（P<0.05），其余3季間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；實驗組春分IL-6水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示自然氣條件下，IL-6水平與季節(jié)有一定的相關性，呈現春秋較高，夏冬較低的趨勢。在摘取松果體后，實驗組金黃地鼠IL-6水平仍存在明顯的季節(jié)性變化，且最低值出現在冬季。見表3。

2.4 2組不同季節(jié)環(huán)境下金黃地鼠血清IgE水平比較

四季對照組與實驗組金黃地鼠血清IgE季節(jié)性水平變化，對照組IgE水平在秋分時最低，春、夏、冬與之相比較高，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明IgE的水平有一定的季節(jié)性規(guī)律；實驗組IgE水平夏秋明顯低于冬春，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；實驗組與對照組比較，實驗組IgE水平整體水平下降，夏至IgE水平實驗組顯著低于對照組（P<0.05）。見表4。

2.5 2組不同季節(jié)環(huán)境下金黃地鼠血清IgG水平比較

四季對照組與實驗組金黃地鼠血清IgG季節(jié)性水平變化，對照組IgG水平秋>夏>春>冬，冬至顯著低于春夏秋3組，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IgG具有季節(jié)性變化規(guī)律且順從“冬藏”的自然節(jié)律；摘除松果體后的實驗組，IgG水平春>夏>冬>秋，春分顯著高于夏秋冬（P<0.05），其季節(jié)變化趨勢與對照組相反，提示松果體對IgG水平有調控作用。見表5。

3 討論

3.1 機體的免疫功能整體存在著季節(jié)性變化態(tài)勢

實驗比較了同組內不同節(jié)氣時間段下金黃地鼠免疫系統(tǒng)的變化情況，及行松果體摘除術的實驗組和對照組之間的差異性，從四季變化對金黃地鼠血清IL-1、IL-2、IL-6、IgE、IgG水平的影響上來討論“腎應冬”理論的內涵，并探討松果體此過程中發(fā)揮的調控作用。本實驗發(fā)現，機體的免疫功能整體存在著明顯的季節(jié)性變化態(tài)勢，大部分免疫指標表現出了春夏高秋冬降低的趨勢，且松果體在此過程中起了部分的調節(jié)作用。

通過四季間的比較，可看出參與免疫系統(tǒng)調節(jié)的IL-2、IL-6、IgE、IgG水平，具有明顯的季節(jié)性變化規(guī)律，隨著季節(jié)波動變化來調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，從而使人體適應環(huán)境氣候的變化。IL-1、IL-2、IgG水平在冬季達到最低，此乃“冬主封藏”的表現。IL-1對照組在秋季最高，提示IL-1在秋季承擔了機體主要的免疫功能，可能與秋季相關疾病如感冒、支氣管哮喘等有關。IL-6春季水平明顯高于其他3季，提示IL-6在春季擔任了主要的免疫任務，此為機體對外來入侵物的初次應答；IL-2在夏季的水平最高，提示IL-2在夏季擔任了主要的免疫任務，此為機體免疫系統(tǒng)的再次免疫應答。對照組IgE的水平在春、夏、秋3季連續(xù)下降，在冬季上升，IgG的水平在春、夏、秋3季連續(xù)升高，而在冬季上升，提示IgE與IgG在免疫功能上存在著這種互補關系，在不同季節(jié)發(fā)揮主要的免疫職能，相互補充機體免疫系統(tǒng)功能。

實驗組和對照組間比較顯示，IL-2在被摘除松果體后失去了季節(jié)變化的規(guī)律性，說明松果體在維持機體適應季節(jié)變化方面有著重要的作用；對照組IgE與IgG水平呈互補關系，而實驗組這種互補關系消失，顯示松果體可調控IgE、IgG的分泌，協調免疫球蛋白的相互關系；實驗組IgE整體水平下降，表明松果體對IgE的分泌有促進作用；IgG對照組水平呈春、夏、秋上升，冬下降趨勢，實驗組呈春、夏、秋下降，冬稍微上升的趨勢，季節(jié)變化趨勢與對照組相反，提示松果體對IgG水平有調控作用，且與IgG水平呈負相關的關系。

通過以上數據分析，可得出如下結論：1）中醫(yī)“腎應冬”與機體免疫功能密切相關。本實驗的大部分免疫指標呈現春夏高、秋冬低的趨勢，機體的免疫功能在冬季下降，這與中醫(yī)“腎應冬，主封藏”理論相應，冬季人體精氣封藏不妄泄，人體各項功能包括免疫功能下降，這種五臟主動適應環(huán)境氣候變化而產生相應內部適應機制的調控，是“藏象應時”理論的內涵之一。2）“腎應冬”與松果體的調節(jié)作用密切相關。本實驗研究從一定程度上說明松果體作為機體的一種高位調節(jié)器官，可部分影響機體的免疫功能，這為松果體是“腎應冬”的中介性物質提供了依據，同時也從神經內分泌免疫角度探討了臟腑的適應性調控[2]。

3.2 松果體作為人體的高位調節(jié)組織，是“腎應冬”的重要中介物質

《素問·寶命全形論》中提到：“天覆地載，萬物悉備，莫貴于人。人以天地之氣生，四時之法成”。人憑借著自然之氣，按照一年四季的法則而生長，體現了人與天同為一氣。人類的生存和健康會受到自然界各種變化的影響，而季節(jié)氣候因素對人體機能的影響尤為密切。“腎應冬”理論是中醫(yī)藏象學說中的理論之一，也是天人相應理論的基本觀點之一，在中醫(yī)理論體系中居重要的地位。其基本內涵是，隨著自然界的四季變化，人體與腎相關的生理機能會隨之改變來與之相適應，腎能夠適應冬季的環(huán)境變化而調整自身以及與其他臟腑之間的關系，以此來維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定[3]?！端貑枴ち?jié)藏象論》指出：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，……為陰中之太陰，通于冬氣”。腎主藏精，宜閉固不宜妄泄，是人體的精氣封藏的根本，其氣通于冬季[4]?！澳I應冬，主封藏”的研究對于進一步探討腎藏象實質內涵有一定的意義。

“四時五臟陰陽”理論是中醫(yī)天人相應理論的重要組成部分，是探討五臟的生理功能與時間節(jié)律關系的理論體系[5]?！拔迮K應時”學說是“四時五臟陰陽”理論中關于人體內在臟腑生理機能與外界時間變化同步性表現的內容，主要體現在“肝應春”“心應夏”“脾應長夏”“肺應秋”“腎應冬”[6]。實驗表明，人體神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)部分指標有明顯冬高夏低的變化規(guī)律[7]。在正常條件下，雄性SD大鼠、雄性金黃地鼠、健康男性的促性腺激素水平及性激素水平，均呈現夏高冬低的趨勢[8-11]。金黃地鼠的下丘腦-垂體-腎上腺軸在冬季的分泌功能相對增強，儲備腎中精氣，來適應寒冷的氣候環(huán)境，為“春生”提供能量[12]。女性絕經后骨質疏松癥在冬季嚴重[13]。這些前期的實驗證明了“腎應冬”研究的可行性與必要性，并提供了可借鑒的思路與方法。此外，松果體在晝夜節(jié)律和季節(jié)性節(jié)律方面起調節(jié)作用，是從現代醫(yī)學角度研究天人相應學說的最佳切入點[14]。

機體各組織器官正常生理功能的運行，離不開機體免疫系統(tǒng)阻隔病原體侵襲人體的保衛(wèi)作用[15]。IL-1主要由活化的單核-巨噬細胞分泌，可參與免疫調節(jié)，刺激T細胞活化，促進B細胞增殖，分泌抗體，是機體中重要的炎性因子[16]。IL-2主要由T細胞分泌，并能活化T細胞，促進B細胞和NK細胞增殖，激活巨噬細胞，促進細胞因子產生，在抗腫瘤、抗感染、維持機體的免疫耐受方面起了重要作用[17]。吳帥帥等[18]近期實驗表明，IL-2可刺激NK細胞抑制和殺傷人腦膠質瘤。IL-6的主要功能是刺激活化B細胞增殖，分泌抗體，刺激T細胞增殖，參與炎性反應，促進血細胞增殖。IgE是介導Ⅰ型變態(tài)反應的免疫球蛋白[19]，當人體首次接觸變應原，機體由B淋巴細胞合成特異性IgE，再次接觸變應原時形成抗原-抗體復合物[20]。IgG是人血清中水平最多的一種免疫球蛋白，大多數抗菌、抗病毒以及抗毒素抗體都為IgG，一些自身抗體和引起Ⅱ、Ⅲ型超敏反應的抗體均屬于此類抗體[21]。本實驗選擇的免疫指標，IL-1、IL-2、IL-6、IgG存在春夏較高，冬季最低的季節(jié)性規(guī)律，說明在冬季，腎精封藏不妄泄，機體各項機能下降，免疫力降低，以此來適應冬季為“春主生發(fā)”積蓄能量和物質基礎；IgE水平在冬季上升，顯示部分冬季多發(fā)性疾病主要由IgE發(fā)揮免疫作用，維持機體健康，提高“正氣”抵御“外邪”。而松果體作為人體的高位調節(jié)組織，是“腎應冬”的重要中介物質。

綜上所述，本研究通過揭示季節(jié)氣候對機體免疫系統(tǒng)生理影響的相關規(guī)律和松果體對免疫系統(tǒng)的調控作用，進一步驗證了天人相應和“腎應冬”的理論，揭示了自然環(huán)境對人體生理功能的影響，發(fā)現了松果體在人體適應自然環(huán)境的過程中發(fā)揮的重要作用，為相關疾病的預防與治療提供了理論依據和方法途徑。

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