李卿 賀宗毅 杜洪飛 周興 梁旭明

中圖分類號 R284.2 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）06-0753-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.08

摘 要 目的：優(yōu)化野馬追抗動脈粥樣硬化有效部位的乙醇提取工藝。方法：以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素含量為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間、提取次數(shù)對野馬追藥材乙醇提取工藝的影響；采用多指標(biāo)評分法，設(shè)計正交試驗法優(yōu)選提取工藝，并進行驗證試驗。結(jié)果：優(yōu)化的提取工藝為采用70%乙醇為提取溶劑，按料液比12 ∶ 1加入，回流提取3次，每次2 h；3批次驗證試驗結(jié)果顯示，所得4種指標(biāo)成分的含量均較高，平均值分別為5.305 3、1.560 1、1.986 5、6.703 6 mg/g（RSD<1.1%，n=3），結(jié)果穩(wěn)定可靠，且與正交試驗結(jié)果一致。結(jié)論：優(yōu)化的野馬追乙醇回流提取工藝穩(wěn)定可靠，可操作性好，能源消耗與成本更適合工業(yè)化生產(chǎn)，為下一步純化、富集野馬追抗動脈粥樣硬化有效成分提供了工藝基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 野馬追；抗動脈粥樣硬化；提取工藝；正交試驗；多指標(biāo)評分法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the ethanol extraction process of anti-atherosclerosis effective fraction of Lindley eupatorium. METHODS： Using the contents of hyperin， quercetin， kaempferol and jaceosidin as indexes， the effects of ethanol volume fraction， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on ethanol extraction technology were investigated. By multiple index scoring method， orthogonal test was designed to optimize extraction technology， and validation test was conducted. RESULTS： The optimal extraction technology was 70% ethanol as extraction solvent with solid-liquid ratio of 12 ∶ 1， reflux extracting for 3 times， 2 h each time. Results of 3 batches of validation tests showed that the contents of 4 marker components were in high level， being 5.305 3， 1.560 1， 1.986 5， 6.703 6 mg/g in average （RSD<1.1%，n=3）. Results of validation tests were stable and reliable， and were in good agreement with the results of orthogonal tests. CONCLUSIONS： The optimized ethanol reflux extraction technology of L. eupatorium is stable and reliable， and performs well. Energy consumption and cost are suitable for industrial production. The results provide technology basis for further purification and enrichment of anti-atherosclerosis effective components of L. eupatorium.

KEYWORDS Lindley eupatorium； Anti-atherosclerosis； Extraction technology； Orthogonal test； Multiple index scoring method

野馬追為菊科澤蘭屬植物輪葉澤蘭（Eupatorium lindleyanum DC.）的干燥地上部分，味苦，性平，有化痰止咳平喘的功能，常用于治療痰多咳嗽氣喘[1]。野馬追藥材含有多種生物活性成分，包括黃酮、生物堿、揮發(fā)油和香豆素等[2]。作為江蘇省特產(chǎn)中藥材，野馬追曾被收入1977年版《中國藥典》（一部）、江蘇省地方藥材標(biāo)準(zhǔn) （1988年版），現(xiàn)收載于2015年版《中國藥典》（一部）。隨著對野馬追藥材的不斷深入研究，相關(guān)報道指出其還具有降血脂、抗動脈粥樣硬化的功能[3-5]。本課題組前期對野馬追藥材不同溶劑提取物的研究發(fā)現(xiàn)，野馬追抗動脈粥樣硬化的有效部位為乙醇回流提取、大孔樹脂富集純化的乙醇洗脫部分，該組分抗動脈粥樣硬化效果與辛伐他汀相當(dāng)，某些效果指標(biāo)甚至優(yōu)于辛伐他汀，試驗結(jié)果將另文發(fā)表。有研究以棕矢車菊素、槲皮素、山柰素為測定指標(biāo)，對野馬追的乙醇提取法進行工藝優(yōu)化[6]。本試驗在前期工作中，發(fā)現(xiàn)野馬追藥材中含有金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素，其中金絲桃苷相對含量較高，且具有抗炎、止咳、降壓、降低膽固醇、保護腦血管等多種生理活性，是一種重要的天然活性成分[7]?；诖?，本研究以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素等黃酮類成分為檢測指標(biāo)，采用正交試驗法對野馬追乙醇回流提取工藝進行考察，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，為進一步純化、富集野馬追抗動脈粥樣硬化有效成分，進而為提高后續(xù)開發(fā)的相關(guān)制劑產(chǎn)品質(zhì)量及臨床效果提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu-2010A高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、可變波長紫外檢測器、自動進樣器（日本島津公司）；KQ-700DB型數(shù)控超聲清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）；AE240電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司]。

1.2 試劑

金絲桃苷對照品（批號：1521-200303，供含量測定用）、槲皮素對照品（批號：100081-200406，供含量測定用）、山柰素對照品（批號：0861-200304，供含量測定用）、棕矢車菊素對照品（批號：110817-200305，供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

1.3 藥材

野馬追藥材（批號：140601）購自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員鑒定為菊科澤蘭屬植物輪葉澤蘭（Eupatorium lindleyanum DC.）的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，20%A→25%A；25～35 min，25%A→32%A；35～50 min，32%A→40%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)以槲皮素峰計應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對照品10.58 mg、槲皮素對照品9.42 mg、山柰素對照品9.37 mg、棕矢車菊素對照品10.25 mg，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。分別精密吸取上述對照品貯備液各5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取野馬追藥材粗粉（批號：140601，以下同），按“2.5”項下正交試驗中的條件進行提取，濾過，合并濾液，濃縮至適量，用95%乙醇定容至100 mL，搖勻；精密量取5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲（功率：200 W，頻率：50 kHz）處理15 min，放冷，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素對照品溶液2、4、8、16、20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以各對照品進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進行回歸分析，得金絲桃苷回歸方程為y=11 076.7x-593.52（r=0.999 9）；槲皮素回歸方程為y=10 068.5x-458.36（r=0.999 9）；山柰素回歸方程為y=9 928.31x-476.06（r=0.999 9）；棕矢車菊素回歸方程為y=11 243.8x-417.22（r=0.999 9）。結(jié)果表明，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素進樣量分別在0.042 32～0.423 2 μg、0.037 68～0.376 8 μg、0.037 48～0.374 8 μg、0.041 00～0.410 0 μg范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素峰面積的RSD分別為0.72%、0.78%、0.80%、0.73%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、4、8、16、20 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素峰面積的RSD分別為0.68%、0.75%、0.88%、0.79%（n=6），表明供試品溶液室溫放置20 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同批野馬追藥材粗粉適量，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素含量的RSD分別為0.83%、0.68%、0.85%、0.87%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 稱取同批野馬追藥材粗粉適量，共9份，精密稱定，分別精密加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的金絲桃苷（0.012 8、0.016 0、0.019 2 mg/mL）、槲皮素（0.005 6、0.007 0、0.008 4 mg/mL）、山柰素（0.006 4、0.008 0、0.009 6 mg/mL）、棕矢車菊素（0.014 4、0.018 0、0.021 6 mg/mL）對照品溶液，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件下進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素平均加樣回收率分別為98.59%、99.16%、98.38%、98.85%，RSD分別為1.20%、1.06%、1.27%、1.19%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 正交試驗優(yōu)化提取工藝

2.5.1 試驗設(shè)計 前期單因素試驗結(jié)果表明，影響金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素提取效果較顯著的因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)，故本試驗選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，采用正交試驗法對野馬追提取工藝進行優(yōu)選。每個因素選取3個水平，以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素為評價指標(biāo)，采用L9（34）表安排試驗。正交試驗因素水平見表1。

2.5.2 試驗方案與結(jié)果 采用4種指標(biāo)成分為考察指標(biāo)，運用綜合加權(quán)評分法進行數(shù)據(jù)處理。對試驗結(jié)果進行綜合加權(quán)評分計算：設(shè)定滿分為 100分，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素含量的權(quán)重系數(shù)均為25，以各個指標(biāo)成分含量的最大值為參照，計算綜合評分（綜合評分=25X金絲桃苷/X金絲桃苷max+25X槲皮素/X槲皮素max+25X山柰素/X山柰素max+25X棕矢車菊素/X棕矢車菊素max）。正交試驗各指標(biāo)成分含量測定結(jié)果見表2（表中max為最大值）；正交試驗安排與綜合評分結(jié)果見表3；綜合評分方差分析結(jié)果見表4。

由表3、表4中的極差值直觀分析和方差分析可得：野馬追提取工藝的各因素影響大小依次為 D （提取次數(shù)）>A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）>C（提取時間）>B（液料比），各因素皆為提取過程中的極顯著性影響因素（P<0.01）；最優(yōu)提取工藝為D3A3C3B3，即按料液比15 ∶ 1加入80%乙醇回流提取3次，每次2 h。由于采用70%乙醇與80%乙醇、液料比12 ∶ 1與15 ∶ 1提取效果差異極小（因素A、B的水平Ⅱ、Ⅲ對應(yīng)的KⅡ/3、KⅢ/3分別為87.50、88.11和84.69、85.23，差值僅為0.61、0.54），考慮到工業(yè)化生產(chǎn)過程中的能源消耗和生產(chǎn)成本，擬確定野馬追的提取工藝為：按料液比12 ∶ 1加入70%乙醇，回流提取3次，每次2 h。

2.5.3 驗證試驗 稱取野馬追藥材粗粉250 g，共3份，按料液比加入70%乙醇，回流提取3次，每次2 h，按“2.1”項下色譜條件測定各指標(biāo)成分含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，按上述優(yōu)化工藝提取后，野馬追各指標(biāo)成分的含量均較高；正交試驗優(yōu)化所得工藝符合生產(chǎn)實際、結(jié)果穩(wěn)定可靠（RSD<1.1%）。

3 討論

野馬追的提取工藝已有文獻報道采用水煎煮法和乙醇提取法[8-11]。本課題組在前期篩選試驗過程中發(fā)現(xiàn)，水煎煮提取液中金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素的含量遠(yuǎn)低于乙醇回流提取液中相關(guān)指標(biāo)成分含量。亦有文獻報道采用乙醇回流提取法，按料液比12 ∶ 1加入90%乙醇進行回流提取[6]，但在工業(yè)化大生產(chǎn)過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)作為生產(chǎn)成本是受到嚴(yán)格管控的，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，既不利于安全生產(chǎn)，且揮發(fā)損失大、回收消耗大，也不利于再次利用。因此，筆者進行正交試驗設(shè)計，優(yōu)化提取工藝，提取野馬追藥材后測定4種指標(biāo)成分的含量結(jié)果顯示，上述指標(biāo)的轉(zhuǎn)移率[轉(zhuǎn)移率（%）=提取后指標(biāo)成分含量/藥材中指標(biāo)成分含量×100%]均達(dá)到85%以上。由此表明，本研究既充分考慮工業(yè)化生產(chǎn)過程中的實際問題，又使得野馬追中的有效指標(biāo)成分能被充分提取。

正交試驗結(jié)果顯示，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素這4個指標(biāo)成分在提取溶劑乙醇不同體積分?jǐn)?shù)條件下，表現(xiàn)出不同的提取效果：4個指標(biāo)成分并不是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化呈現(xiàn)同時增加或降低的趨勢，這可能與4個指標(biāo)成分在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解性差異有關(guān)。

綜上所述，本試驗以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素4種成分為考察指標(biāo)，優(yōu)選野馬追藥材的乙醇提取工藝，評價方法更合理，所優(yōu)選的提取工藝可操作性更好，為下一步純化、富集野馬追抗動脈粥樣硬化有效成分提供了工藝基礎(chǔ)。本研究不足之處在于僅以4種黃酮類成分作為野馬追抗動脈粥樣硬化有效部位提取工藝的檢測指標(biāo)，可能未全面反映野馬追有效部位的物質(zhì)作用基礎(chǔ)。故筆者下一步擬對野馬追藥材中含量也較高的生物堿、萜內(nèi)酯類等成分開展分離純化等工作，并進行相關(guān)的藥效學(xué)、毒理學(xué)比較研究，以期為野馬追藥材的全面利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

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（收稿日期：2017-10-14 修回日期：2018-01-26）

（編輯：段思怡）