肖會(huì)敏 張俏 何悅 劉洋 張明科 王四旺

中圖分類號(hào) R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）06-0749-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.07

摘 要 目的：建立復(fù)視明膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中藁本內(nèi)酯、橙黃決明素、大黃酚、枸杞子和水蛭進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中葛根素和人參皂苷Rb1的含量，色譜柱為Intersil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：藁本內(nèi)酯、橙黃決明素、大黃酚、枸杞子和水蛭的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾。葛根素、人參皂苷Rb1檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.56～337.92 μg/mL（r=0.999 7）、17.80～569.70 μg/mL（r=0.999 6）；定量限分別為2.20、1.86 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.12、0.13 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%；加樣回收率分別為95.65%～99.66%（RSD=1.45%，n=6）、96.95%～98.52%（RSD=0.77%，n=6）。結(jié)論：所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于復(fù)視明膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 復(fù)視明膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；人參皂苷Rb1；葛根素

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish quality standard of Fushiming capsule. METHODS： TLC was used to qualitatively identify the ligustilide， aurantio obtusin， chrysophanol， fruit of Chinese wolfberry and Whitmania pigra， respectively. HPLC method was used to determine the contents of puerarin and ginsenosides Rb1. The determination was performed on Intersil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid （gradient elution）at flow rate of 1.0 mL/min； the detection wavlength was set at 203 nm， and column temperature was 25 ℃； the sample size was 10 μL. RESULTS： TLC spots of ligustilide， aurantio obtusin， chrysophanol， the fruit of C. wolfberry and W. pigra were clear and well separated without negative interference. The linear range of puerarin and ginsenoside Rb1 were 10.56-337.92 μg/mL（r=0.999 7） and 17.80-569.70 μg/mL（r=0.999 6）. The limits of quantitation were 2.20，1.86 μg/mL， and the limits of detection were 0.12，0.13 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 2.0%. The recoveries were 95.65%-99.66%（RSD=1.45%，n=6） and 96.95%-98.52%（RSD=0.77%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： Established quality standard can be used for the quality control of Fushiming capsule.

KEYWORDS Fushiming capsule； Quality standard； TLC； HPLC； Ginsenosides Rb1； Puerarin

復(fù)視明膠囊由西洋參、葛根、黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、決明子、紅花、珍珠、葛根、枸杞子、水蛭、絲瓜絡(luò)、桂枝等13味中藥材組合而成，主治糖尿病引起的眼底視網(wǎng)膜病變。西洋參藥材主要成分為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re等[1]，研究表明人參皂苷Rb1對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生具有抑制作用，對(duì)模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用[2]；黃芪藥材可以治療單純性糖尿病視網(wǎng)膜病變[3]；葛根藥材中的葛根素具有改善視網(wǎng)膜微循環(huán)的作用[4]；枸杞子藥材對(duì)模型大鼠視網(wǎng)膜色素變性具有抑制作用，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有保護(hù)作用[5]；當(dāng)歸藥材中的藁本內(nèi)酯對(duì)早期糖尿病視網(wǎng)膜病變有改善作用[6]；決明子藥材有保肝明目等作用[7]；水蛭藥材對(duì)糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜微血管形態(tài)有改善作用[8]?；诖?，筆者采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中藁本內(nèi)酯、橙黃決明素、大黃酚、枸杞子和水蛭進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定制劑中葛根素和人參皂苷Rb1的含量，以為復(fù)視明膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010CHT型HPLC儀，包括自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；R200D型十萬分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；TM-B5002型臺(tái)式天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）； KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司） 。

1.2 藥品與試劑

復(fù)視明膠囊（西安樂健生物科技有限公司，批號(hào)：20150801、20150802、20150803，規(guī)格：400 mg/粒）；葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110766-200417，純度：96.0%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201424，純度：93.7%）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111737-201407，純度：100%）、橙黃決明素對(duì)照品（批號(hào)：111900-201404，純度：98.3%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201420，純度：99.2%）、枸杞子對(duì)照藥材（批號(hào)：121072-201410）、水蛭對(duì)照藥材（批號(hào)：121061-201305）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板、硅膠H薄層板（青島裕民源硅膠試劑廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 藁本內(nèi)酯 取樣品內(nèi)容物4 g，加乙醚50 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。按復(fù)視明膠囊處方和工藝制備缺當(dāng)歸的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[9]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

2.1.2 橙黃決明素和大黃酚 取樣品內(nèi)容物5 g，加甲醇50 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加鹽酸2 mL，置水浴上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品各適量，加無水乙醇-乙酸乙酯（2 ∶ 1，V/V）制成橙黃決明素、大黃酚質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。按復(fù)視明膠囊處方和工藝制備缺決明子的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[9]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-丙酮（2 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾；經(jīng)氨氣熏蒸后，可見斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚），詳見圖2。

2.1.3 枸杞子 取樣品內(nèi)容物2 g，加水50 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理15 min，以半徑為12 cm、4 000 r/min離心5 min，取上清液，以乙酸乙酯30 mL振搖提取，分取乙酸乙酯層，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，加水35 mL，加熱煮沸15 min，放至室溫，濾過，濾液用乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯層，濃縮至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。按復(fù)視明膠囊處方和工藝制備缺枸杞子的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按 2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[9]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖3。

2.1.4 水蛭 取樣品內(nèi)容物10 g，加乙醇100 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取水蛭對(duì)照藥材1 g，加乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。按復(fù)視明膠囊處方和工藝制備缺水蛭的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[9]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（4 ∶ 1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置日光燈和紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖4。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Intersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，15%A→20%A；25～60 min，20%A→40%A；60～70 min，40%A→45%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品8.8 mg、人參皂苷Rb1對(duì)照品15.2 mg，置于同一20 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過；精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按復(fù)視明膠囊處方和工藝分別制備缺葛根、西洋參的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成單一陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，理論板數(shù)以人參皂苷Rb1峰計(jì)大于4 000；分離度大于1.5，各成分基線分離良好，詳見圖5。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mL，分別置于5 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以葛根素、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得葛根素、人參皂苷Rb1回歸方程分別為y=55 075x-35 821（r=0.999 7）、y=3 366x+35（r=0.999 6）。結(jié)果表明，葛根素、人參皂苷Rb1檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.56～337.92、17.80～569.70 μg/mL。

2.2.7 定量限與檢測(cè)限考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，葛根素、人參皂苷Rb1定量限分別為2.20、1.86 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.12、0.13 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照品溶液（葛根素、人參皂苷質(zhì)量濃度分別為42.24、71.21 μg/mL），取適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為 0.58%、0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20150801）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.32%、1.45%（n=5），表明供試品溶液于室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：20150801）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，葛根素、人參皂苷Rb1含量平均值分別為9.46、4.75 mg/g， RSD分別為1.29%、1.54%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（批號(hào)：20150801）適量，共6份，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.12 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

當(dāng)歸的化學(xué)成分主要包括藁本內(nèi)酯類及其異構(gòu)物、香豆素類、多糖類、黃酮類及有機(jī)酸類等。藁木內(nèi)酯TLC預(yù)試驗(yàn)中，筆者對(duì)不同比例正己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)的展開結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在正己烷-乙酸乙酯（4 ∶ 1，V/V）條件下比移值（Rf）適中，在紫外光燈（365 nm）下，當(dāng)歸特征斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾。決明子含有蒽醌類、苯丙吡咯酮類、苷類、脂肪酸類等成分[7]，因此筆者選擇其有效成分橙黃決明素、大黃酚作為鑒別指標(biāo)。兩者TLC預(yù)試驗(yàn)中，筆者對(duì)乙醇-乙酸乙酯（2 ∶ 1，V/V）、甲醇-乙酸乙酯（2 ∶ 1，V/V）、石油醚（30～60 ℃）-丙酮（2 ∶ 1，V/V）系統(tǒng)下的展開結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在石油醚（30～60 ℃）-丙酮（2 ∶ 1，V/V）條件下Rf適中，決明子特征斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾[7]。枸杞子化學(xué)成分較復(fù)雜，主要成分為胡蘿卜素、核黃素、硫胺素、煙酸、亞油酸、抗壞血酸等[10]。枸杞子TLC預(yù)試驗(yàn)中，筆者對(duì)不同比例乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸系統(tǒng)的展開結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）條件下Rf適中，在紫外光燈（365 nm）下枸杞子特征斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾[5]。水蛭含有多肽類、肝素、抗血栓素、氨基酸以及鎮(zhèn)痛酶、抗炎酶和溶血酶等成分[7]。水蛭TLC預(yù)試驗(yàn)中，筆者對(duì)不同比例環(huán)己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)的展開結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在環(huán)己烷-乙酸乙酯（4 ∶ 1，V/V）條件下，水蛭特征斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾。另在TLC預(yù)試驗(yàn)中，黃芪鑒別結(jié)果顯示陰性對(duì)照有干擾；桂枝與紅花處方比例小，均未檢出特征斑點(diǎn)；對(duì)熟地黃中毛蕊花糖苷進(jìn)行鑒別，結(jié)果陰性對(duì)照有干擾。因此，上述藥材均未列入標(biāo)準(zhǔn)。

在色譜條件摸索中，經(jīng)過不同柱溫（20、25、30、35、40 ℃）、不同色譜洗脫系統(tǒng)[甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液（0.30%、0.15%、0.07%）、乙腈-磷酸溶液（0.30%、0.15%、0.07%）]、不同進(jìn)樣量（5、10、20 μL）及不同超聲時(shí)間（10、20、30、40 min）比較，筆者發(fā)現(xiàn)雖然制劑中西洋參為全粉入藥，而葛根經(jīng)過醇提取，但由于組方較大、成分復(fù)雜、干擾多，以致出現(xiàn)人參皂苷Rg1和人參皂苷分離度不好、基線不平穩(wěn)（因此兩者未列入標(biāo)準(zhǔn)），人參皂苷Rb1出峰時(shí)間過長(zhǎng)等現(xiàn)象。經(jīng)過對(duì)色譜條件的調(diào)整，制劑中葛根素、人參皂苷Rb1含量的方法學(xué)考察等，最終筆者建立了操作簡(jiǎn)單、靈敏、專屬性可靠、重復(fù)性良好的HPLC法，用以測(cè)定本制劑中葛根素與人參皂苷Rb1的含量。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于復(fù)視明膠囊的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-05-23 修回日期：2017-06-29）

（編輯：張 靜）