薩出拉　那生桑

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010110;　2.內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010110)

松蘿為松蘿科植物長(zhǎng)松蘿Usnea longissima Ach.或節(jié)松蘿Usnea diffracta Vain.的絲狀體。是蒙醫(yī)常用藥材，蒙藥名為斯日古德、阿拉坦-烏塔斯-烏布斯，以全草入藥[1]。蒙藥松蘿味苦，性涼，效鈍、軟、柔；具有清熱、解毒之功效，主治毒癥，腹鳴，泄瀉，腸熱，筋腱疼痛，肺膿瘍等[2]。蒙醫(yī)藥多部文獻(xiàn)均有記載。如《認(rèn)藥白晶鑒》記：“纏繞于松樹，生于草灘溝岸灌叢中”?！稛o(wú)誤蒙藥鑒》則曰：“該條所植物形狀似菟絲子，但菟絲子為有花植物，不符《認(rèn)藥白晶鑒》所述形態(tài)特征”該條所植物形狀似菟絲子，但菟絲子為有花植物，不符《認(rèn)藥白晶鑒》所述形態(tài)特征?！吨袊?guó)醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)》、《蒙藥志》等近代蒙醫(yī)藥書籍均認(rèn)為松蘿為正品，故認(rèn)定歷代蒙醫(yī)藥文獻(xiàn)所載的斯日古德即阿拉坦-烏塔斯-烏布斯為我們所說(shuō)的松蘿[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛等作用[6-9]，其主要含有巴爾巴地衣酸地弗地衣酸 、松蘿酸 、地衣聚糖 、長(zhǎng)松蘿含有多糖 、扁枝衣酸乙酯等[10]。本文對(duì)藥材的性狀及纖維特征進(jìn)行考證，并對(duì)其所含的松蘿酸進(jìn)行了含量測(cè)定，從而為蒙藥松蘿飲片的生藥學(xué)鑒定及含量測(cè)定提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器設(shè)備LC-20A型島津高效液相色譜儀(日本)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；AB135-S型電子天平(METTLER TOLEDO Made in Switerland)；JA5003N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；ZF-I型三用紫外分析儀器(上海古村電光儀器廠)；薄層板為自制硅膠GF254板。

1.2試劑與試藥松蘿(市場(chǎng)購(gòu)置，批號(hào)20151012和20151227；河北購(gòu)置，批號(hào)20160715)經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為節(jié)松蘿Usnea diffracta Vain.干燥的全草。松蘿酸(批號(hào)15120506，含量>98%，購(gòu)自北京中科儀友化工技術(shù)研究院)。乙腈、甲醇為色譜純；超純水；其他試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1藥材定性分析

2.1.1性狀鑒別本品為地衣體絲狀，較粗壯，淡灰綠色或淡黃棕色。枝體表面有多數(shù)環(huán)狀裂溝。橫斷面可見(jiàn)中央有線狀強(qiáng)韌性的重軸，具彈性，由菌絲組成；其外為藻環(huán)，常有環(huán)狀溝紋分離成短筒狀。

2.1.2顯微鑒別本品粉末灰綠色。菌絲線狀成束，無(wú)色，直徑6～12μm。藻細(xì)胞類圓形成群，含葉綠體，呈綠色，直徑8～15μm。如圖1。不同批次樣品均顯此特征，故將此特征作為蒙藥松蘿飲片的粉末特征。

2.1.3薄層鑒別取松蘿粉碎(過(guò)5號(hào)篩)或松蘿粉5.0g，置索氏提取器內(nèi)，加三氯甲烷適量，加熱回流提取4h，提取液濃縮后，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取松蘿酸對(duì)照品，用三氯甲烷配制成每1mL含1.0mg制成對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版通則0502)試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一含羧甲基纖維素鈉的硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-苯-冰乙酸(7:2:1)為展開劑，飽和1h展開，取出，熱風(fēng)吹干，置紫外燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。如圖2。不同批次樣品均有此特征，故將本方法作為蒙藥松蘿飲片薄層鑒別方法。

2.2檢查由于本品為全草類藥材，在采集和運(yùn)輸過(guò)程中易帶入泥沙、塵土等非藥用部分，同時(shí)容易受到干燥或潮濕環(huán)境的影響，故對(duì)藥材的水分、總灰分進(jìn)行限度檢查，以控制藥材的純度。

2.2.1水分照《中國(guó)藥典》(2015版四部通則0832 第二法)進(jìn)行水分測(cè)定。

取3批樣品，每批約2～5g，平鋪于干燥置至恒重的扁型稱量瓶中，厚度不超過(guò)5mm,疏松供試品不超過(guò)10mm，精密稱定，開啟瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，至連續(xù)2次稱重的差異不超過(guò)5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算樣品的含水量。結(jié)果表明，3批樣品水分含量在9.71%～9.82% ，均值為9.76% ，故規(guī)定蒙藥材松蘿水分含量不得過(guò)11%。結(jié)果如表1。

表1　松蘿水分含量測(cè)定

2.2.2灰分照《中國(guó)藥典》(2015版四部通則2302)進(jìn)行總灰分測(cè)定。

取三批樣品，每批約5g(通過(guò)2號(hào)篩)，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量，緩緩熾熱，至完全炭化，逐漸升溫至500～600℃，使完全灰化并至恒重，根據(jù)殘?jiān)?，?jì)算樣品種總灰分的含量0.972(%)。結(jié)果表明，3批樣品總灰分含量在0.966%～0.982%之間，平均值為0.972；故規(guī)定蒙藥材松蘿總灰分不得過(guò)1.2%，結(jié)果如表2。

表2　松蘿總灰分含量測(cè)定表

2.3浸出物的測(cè)定照醇溶性浸出物測(cè)定法《中國(guó)藥典》(2015年版 四部通則2201)熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑。

3批樣品的乙醇浸出物在4.19%～4.58%之間，平均值為4.42%。故規(guī)定蒙藥松蘿醇溶性浸出物(熱浸法)不得少于3.50% ，結(jié)果如表3。

表3　松蘿醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果

2.4含量測(cè)定松蘿中含有多種有效成分，如松蘿酸(usnic acid)、地弗地衣酸(diffractaic acid)、巴爾巴地衣酸、脂肪酸、多糖等化合物。松蘿酸又名地衣酸，具有旋光性，在地衣中發(fā)現(xiàn)(+)及(-)2中形式[11]。松蘿酸易溶于丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷甲醇混合液中[10]，還有文獻(xiàn)報(bào)到以甲醇為溶劑，取得了較好的提取效果[12]。松蘿因此本實(shí)驗(yàn)選擇了色譜甲醇從松蘿中提取松蘿酸，比此方法提取量最多且操作簡(jiǎn)便。

2.4.1色譜條件Packed Column 5C18分析住(4.6×250mm ,5μm)；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：乙腈(A), 5%冰乙酸 (B)，分析柱流動(dòng)相比例：A:B=78:22；流速：1mL/min。

流動(dòng)相的選擇：對(duì)流動(dòng)相甲醇-水(85:15)、乙腈：25%乙酸溶液(78:22)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選。結(jié)果表明，以乙腈：25%乙酸溶液(78:22)為流動(dòng)相色譜峰形理想、分離度好。但有些拖尾，因此考察了不同濃度的乙酸溶液(25%、20%、10%、5%、1%乙酸溶液)，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相以乙腈：5%乙酸溶液(78:22)時(shí)不拖尾、保留時(shí)間短、峰純度好，故選擇該流動(dòng)相。

2.4.2溶液的制備

2.4.2.1供試品溶液的制備供試品提取溶液的選擇：分別做了乙酸乙酯熱回流提取、丙酮超聲提取及色譜甲醇超聲提取，結(jié)果表明，色譜甲醇提取最為有效的溶劑，此方法提取量最多且操作簡(jiǎn)便。

取本品粉末(過(guò)5號(hào)篩)約0.1g，精密稱定，置于具塞100mL錐形瓶中，精密加入60mL色譜甲醇，密塞，超聲處理(功率300W，頻率40kHz)20min，放冷5min，過(guò)濾，取續(xù)濾液即可。

2.4.2.2對(duì)照品溶液的制備取松蘿酸對(duì)照品適量，精密稱定，加色譜甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，搖勻，即可。

2.4.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在上述色譜條件下精密吸取對(duì)照品溶液10μL,注入液相色譜儀，記錄峰面積。松蘿酸的濃度為(0.5mg/mL)。松蘿酸與雜質(zhì)峰分離效果較好，理論塔數(shù)以松蘿酸峰計(jì)算為3000，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3～6。

2.4.4線性關(guān)系考察取松蘿對(duì)照品，制成濃度分別30、40、50、100、150、250μg/mL的溶液，依次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以對(duì)照品的濃(μg/mL)峰面積縱坐標(biāo)，可見(jiàn)松蘿酸在30-250μg/mL范圍內(nèi)，得到松蘿酸線性回歸方程Y=12938X-237883，R2=0.9999，線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖7。

2.4.5精密度試驗(yàn)取樣品溶液進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，重復(fù)操作5次，記錄峰面積.結(jié)果RSD≤2.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.6重復(fù)性試驗(yàn)取5份同一供試品溶液(批號(hào)：20151227)，依次各取溶液10μL進(jìn)樣(過(guò)濾后)，記錄峰面積，結(jié)果RSD≤2.18%，表明本法重復(fù)性較好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次樣品，依次在0h、2h、4h、8h、10h、12h下取溶液(過(guò)濾后)進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果 RSD≤3.81%，表明供試品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8加樣回收試驗(yàn)考察精密稱取供試品溶液6份(0.025g)，分別置于,6個(gè)相同規(guī)格的容量瓶中，各加入15mL色譜甲醇，再精密加入松蘿酸對(duì)照品，超聲20min，放冷，過(guò)濾，按含量測(cè)定方法精密吸取10μL進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算出含量、回收率以及RSD。結(jié)果如表4,平均回收率為100.8 %，RSD為1.15% ,表明本方法準(zhǔn)確可靠。

表3　松蘿醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果

2.4.9樣品含量測(cè)定精密吸取不同批次樣品的供試品溶液各3份，每份注入10μL,按上述同樣條件測(cè)定。結(jié)果如表5，松蘿酸含量在7.23%～7.49 %之間，平均含量為7.44%，故規(guī)定松蘿中松蘿酸的含量不得少于6.0%。

表5　松蘿含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3　討論

在松蘿酸含量測(cè)定研究中對(duì)流動(dòng)相和供試品提取溶液進(jìn)行了平行對(duì)照選擇，結(jié)果：流動(dòng)相以乙腈：5%乙酸溶液(78:22)時(shí)不拖尾、保留時(shí)間短、峰純度好，故選擇該流動(dòng)相。供試品提取以色譜甲醇提取最為有效的溶劑，此方法提取量最多且操作簡(jiǎn)便。

松蘿作為蒙醫(yī)常用的藥材，其飲片入味于多種復(fù)方制劑，雖然關(guān)于其質(zhì)量研究報(bào)道，但在蒙醫(yī)藥飲片領(lǐng)域的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究尚未報(bào)道。并且節(jié)松蘿研究至今空白，因此本實(shí)驗(yàn)主要研究的是節(jié)松蘿。本研究參考《中國(guó)藥典》(2015年版一部)，結(jié)合松蘿蒙醫(yī)藥用藥特點(diǎn)，從飲片的性狀、顯微、水分、總灰分、浸出物、松蘿酸含量等方面進(jìn)行了研究，并初步擬定了其質(zhì)量控制范圍，建立了較為完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，為保證松蘿飲片及其復(fù)方制劑的臨床療效的均一性和穩(wěn)定性提供了較為完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。