袁雪梅，王敏，藏金萍，曹宏哲，張康，張靖，邢繼紅，董金皋

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灰葡萄孢犬尿氨酸單加氧酶基因與病菌cAMP信號途徑的關系

袁雪梅，王敏，藏金萍，曹宏哲，張康，張靖，邢繼紅，董金皋

（河北農業(yè)大學生命科學學院/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/河北農業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北保定 071000）

【目的】明確灰葡萄孢（）犬尿氨酸單加氧酶基因與病菌cAMP信號途徑之間的關系，為進一步闡明調控灰葡萄孢生長、發(fā)育和致病力的分子機制打下基礎?！痉椒ā坷胏AMP信號途徑特異性抑制劑SQ22536，檢測灰葡萄孢野生型BC22、的T-DNA插入突變體BCG183和回復菌株BCG183/對cAMP信號途徑特異性抑制劑的敏感性；分別提取灰葡萄孢野生型BC22、突變體BCG183和回復菌株BCG183/中的cAMP，利用HPLC檢測各菌株中cAMP的含量；利用real-time PCR技術檢測與cAMP信號途徑中cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）的催化亞基基因和、調節(jié)亞基基因、編碼異源三聚體G-蛋白G亞基基因和在病菌不同發(fā)育階段、組織部位以及培養(yǎng)條件下的表達規(guī)律；利用real-time PCR技術檢測突變體中cAMP信號途徑關鍵基因、、、、的表達水平；利用real-time PCR技術檢測cAMP信號途徑關鍵基因、、、、的RNAi突變中的表達水平?！窘Y果】灰葡萄孢的T-DNA插入突變體BCG183對cAMP信號途徑特異性抑制劑SQ22536不敏感，受抑制的程度明顯低于野生型BC22和回復菌株BCG183/。的T-DNA插入突變體BCG183中cAMP含量明顯低于野生型菌株BC22和回復菌株BCG183/。與cAMP信號途徑中cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）的催化亞基基因、編碼異源三聚體G-蛋白G亞基基因和的表達規(guī)律基本一致，均為在7 d的菌絲和菌核中表達水平較高；此外，和cAMP信號途徑關鍵基因、、、、均為在含果糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)的病菌中表達水平較高。的T-DNA插入突變體BCG183中cAMP信號途徑關鍵基因、、、、的表達水平均明顯高于野生型BC22和回復菌株BCG183/。、的RNAi突變體中表達水平明顯高于野生型，而、、的RNAi突變體中表達水平明顯低于野生型。【結論】負調控cAMP信號途徑關鍵基因、、、、的表達；cAMP信號途徑關鍵基因、負調控的表達，而cAMP信號途徑關鍵基因、、正調控的表達。

灰葡萄孢；；cAMP信號途徑

0 引言

【研究意義】灰葡萄孢（）是一種重要的植物病原真菌，在全球230多種植物上造成灰霉病[1-2]。由于灰葡萄孢的寄主范圍廣泛，遺傳變異速度快，產(chǎn)生的菌核抵抗逆境能力強，使得灰霉病很難防控[3-6]。隨著灰葡萄孢菌株B05.10和T4基因組序列的發(fā)布，灰葡萄孢已經(jīng)成為研究病原物與植物互作的模式真菌[7]。探究灰葡萄孢生長、發(fā)育與致病的分子機制，不僅可為制定持久控制灰霉病的策略提供理論依據(jù)和實踐基礎，同時對研究其他真菌的遺傳、發(fā)育和致病性具有重要參考價值?！厩叭搜芯窟M展】灰葡萄孢的cAMP信號途徑在病菌生長、發(fā)育和致病過程中發(fā)揮著重要的調控作用[8]，該途徑中包括3個編碼異源三聚體G-蛋白G亞基（Gsubunits）的基因[9-10]、[11]和[12]，腺苷酸環(huán)化酶編碼基因（adenylate cyclase）[13]，cAMP依賴的蛋白激酶（the cAMP-dependent protein kinase，PKA）催化亞基基因（PKA catalytic subunit）、（PKA catalytic subunit）和調節(jié)亞基基因（PKA regulatory subunit）[14]，這些基因突變均會影響病菌的生長、發(fā)育和致病力。的缺失突變體?能夠產(chǎn)生分生孢子，穿透植物組織，但不能產(chǎn)生軟腐癥狀[9-10]。和的缺失突變體Δ和Δ雖可以侵染寄主，但是侵染速度較野生型緩慢[11-12]。的缺失突變體Δ在寄主體內不能產(chǎn)生分生孢子，但在培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力不受影響，侵染速度較野生型慢[13]。的缺失突變體Δ生長緩慢，不能在寄主葉片上產(chǎn)生病斑，但在寄主葉片上的產(chǎn)孢能力不受影響[14]。的缺失突變體Δ在生長速度、分生孢子萌發(fā)、侵染寄主等方面與野生型沒有明顯差別[14]。缺失會導致突變體組成型激活PKA，使突變體?的表型與突變體?基本一致[14]?！颈狙芯壳腥朦c】實驗室前期獲得了灰葡萄孢致病相關基因（kynurenine 3-monooxygenase），明確了正調控病菌的生長、發(fā)育，負調控病菌的致病力，確定了通過調控病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力、致病相關基因及信號途徑基因的表達而影響病菌的致病力[15-17]。但是該基因與病菌cAMP信號途徑之間的關系尚未明確?！緮M解決的關鍵問題】通過檢測灰葡萄孢突變體對cAMP信號途徑抑制劑的敏感性、突變體中cAMP含量以及與cAMP信號途徑關鍵基因的表達規(guī)律、突變對cAMP信號途徑關鍵基因表達的影響，以及cAMP信號途徑關鍵基因突變對表達的影響，確定與cAMP信號途徑關鍵基因之間的關系，為闡明調控病菌生長、發(fā)育和致病力的分子機制打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2017年在河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/河北農業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室完成。

1.1 試驗材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22、的T-DNA插入突變體BCG183、回復菌株BCG183/、cAMP信號途徑關鍵基因、、、、的RNAi突變體菌株，均由河北農業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存并提供。

1.2 突變體對cAMP信號途徑抑制劑的敏感性檢測

在滅菌后的PDA培養(yǎng)基中加入cAMP信號途徑特異性的抑制劑SQ22536母液，使SQ22536終濃度為10 μmol·L-1，然后接種培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢野生型菌株BC22、的T-DNA插入突變體BCG183和的回復菌株BCG183/的菌盤（直徑為5 mm），20℃條件下培養(yǎng)，觀測病菌菌落的生長速率。同時，以在PDA培養(yǎng)基中加入與SQ22536母液等量的DMSO為空白對照。

1.3 突變體中cAMP的含量檢測

分別提取灰葡萄孢野生型BC22、突變體BCG183和回復菌株BCG183/中的cAMP，利用HPLC檢測各菌株中cAMP的含量。cAMP的提取方法：稱取約0.1 g樣本，加入液氮研磨后，加入1 mL水，并將其轉移至1.5 mL離心管中，50℃水浴1 h并且振蕩3—4次，8 000×離心10 min，取上清液，氮氣吹干后定容至0.5 mL，渦旋振蕩溶解，過濾后待測。HPLC液相條件：Agilent 1100高效液相色譜儀，Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A：一定濃度的KH2PO4水溶液。流動相B：色譜級甲醇1 L，A﹕B=80﹕20。樣品進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱溫30℃，走樣時間為20 min，紫外波長254 nm。

1.4 BcKMO與cAMP信號途徑關鍵基因的表達規(guī)律分析

1.4.1 病菌不同發(fā)育階段、不同部位的基因表達規(guī)律分析 分別收集野生型菌株BC22的菌絲生長時期、附著胞發(fā)育時期、分生孢子時期和菌核發(fā)育時期的菌絲、分生孢子和菌核，提取其RNA，反轉錄成cDNA。利用real-time PCR技術，以作為內參，分析和cAMP途徑關鍵基因、、、、的表達規(guī)律。反應體系（10 μL）：模板cDNA 1.0 μL、Mix（5 U·μL-1）5 μL、引物（10 μmol·L-1）0.2 μL。反應程序：95℃ 10 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為35次，每個樣品重復3次。

1.4.2 不同培養(yǎng)條件對和cAMP信號途徑關鍵基因表達的影響 將灰葡萄孢野生型菌株BC22分別接種在含蔗糖、葡萄糖、果糖、甘油的YEB培養(yǎng)基中，在20℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，提取其RNA，反轉錄成cDNA。以作為內參，利用real-time PCR技術，分析、、、、的表達情況。具體反應體系同上。

1.5 BcKMO基因突變對cAMP信號途徑關鍵基因表達的影響

利用real-time PCR技術，檢測野生型菌株BC22、突變體BCG183、回復菌株BCG183/中cAMP信號途徑關鍵基因的表達水平。以BC22、BCG183、BCG183/的cDNA為模板，以為內參，用cAMP信號途徑關鍵基因的特異性引物（表1）進行熒光定量PCR檢測。

1.6 cAMP信號途徑關鍵基因突變對BcKMO表達的影響

利用real-time PCR技術，檢測cAMP信號途徑關鍵基因RNAi突變體中的表達水平。以cAMP信號途徑關鍵基因RNAi突變體的cDNA為模板，為內參，用特異性引物（表1）進行熒光定量PCR檢測。

2 結果

2.1 突變體對cAMP信號途徑抑制劑的敏感性

檢測灰葡萄孢野生型菌株BC22、的T-DNA插入突變體BCG183和回復菌株BCG183/對cAMP信號途徑特異性抑制劑SQ22536的敏感性，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183對抑制劑SQ22536的敏感性明顯低于野生型和回復菌株，抑制率測定結果也表現(xiàn)出突變體BCG183受抑制的程度明顯降低（圖1）。

2.2 突變體中cAMP含量檢測

利用HPLC方法，檢測灰葡萄孢野生型BC22、突變體BCG183和回復菌株BCG183/中的cAMP含量。結果發(fā)現(xiàn)，突變體BCG183中cAMP含量明顯低于野生型和回復菌株BCG183/（圖2）。

A：敏感性測定Sensitivity detection；B：抑制率檢測Detection of inhibition rate

圖2 突變體中cAMP含量的測定

2.3 BcKMO與cAMP信號途徑關鍵基因的表達規(guī)律分析

2.3.1 病菌不同發(fā)育階段、不同組織部位的基因表達分析 利用real-time PCR技術，以作為內參基因，檢測在病菌不同發(fā)育階段、不同部位和cAMP信號途徑關鍵基因的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，和cAMP信號途徑關鍵基因在菌絲、分生孢子和菌核中均有所表達，在6—8 d的菌絲和菌核中表達水平高；cAMP途徑關鍵基因、、的表達規(guī)律與基本一致，均是在6、7 d的菌絲和菌核中表達水平高；cAMP途徑關鍵基因、在6、7 d的菌絲中表達水平較高，但在菌核和分生孢子中的表達水平相對較低（圖3）。

表1 Real-time PCR引物設計

1—6：菌絲生長第3—8天 The 3rd to 8th day of mycelia growth；7：菌絲生長第15天 The 15th day of mycelia growth；8：菌核 Scleroia；9：分生孢子Conidia

2.3.2 不同培養(yǎng)條件對和cAMP信號途徑關鍵基因表達的影響 提取不同培養(yǎng)條件下生長的野生型菌株BC22的總RNA，反轉錄成cDNA，利用real-time PCR技術，以作為內參基因，檢測和cAMP信號途徑關鍵基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，和cAMP信號途徑關鍵基因均在含果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的病菌中表達水平最高（圖4）。

2.4 BcKMO基因突變對cAMP信號途徑關鍵基因表達的影響

利用real-time PCR技術，檢測野生型菌株BC22、突變體BCG183和回復菌株BCG183/中cAMP信號途徑關鍵基因的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，野生型和回復菌株中cAMP信號途徑關鍵基因表達水平基本一致，而在突變體BCG183中cAMP途徑關鍵基因、、、、的表達水平均明顯高于野生型和回復菌株（圖5）。

2.5 cAMP信號途徑關鍵基因突變對BcKMO表達的影響

利用real-time PCR技術，檢測cAMP信號途徑關鍵基因RNAi突變體中的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，、的RNAi突變體中表達水平明顯高于野生型，而、、的RNAi突變體中表達水平明顯低于野生型（圖6）。

3 討論

真菌的cAMP信號途徑可以參與不同的生物進程，包括病菌的生長[18]、分生孢子形成[19]、分生孢子萌發(fā)[20-23]、次生代謝[24-25]、營養(yǎng)感知[26-27]、應激反應[18,23]、菌核發(fā)育[28]、致病性或毒力[29]?；移咸焰遚AMP信號途徑相關基因突變影響病菌的生長、發(fā)育和致病力，如[9-10]、[11]、[12]、[13]、、和[14]等基因突變均會影響病菌的生長、發(fā)育和致病力。

圖4 不同培養(yǎng)條件對BcKMO和cAMP信號途徑關鍵基因表達的影響

圖5 突變體BCG183和BCG183/BcKMO中cAMP信號途徑關鍵基因的表達分析

筆者實驗室前期明確了正調控病菌的生長、發(fā)育，負調控病菌的致病力[15-16]，但是該基因是否通過病菌的cAMP信號途徑起作用，以及該基因與病菌cAMP信號途徑關鍵基因之間的關系尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)的T-DNA插入突變體BCG183對cAMP信號途徑特異性抑制劑SQ22536不敏感，其抑制率明顯低于野生型和回復菌株；而回復菌株的抑制率明顯高于野生型，這與回復菌株中的高水平表達相一致[16]，表明的表達水平與菌株對抑制劑的敏感性呈正相關。突變體BCG183和回復菌株中的cAMP含量明顯低于野生型，且突變體BCG183中的cAMP含量最低，表明菌株中的高水平表達和低水平表達均對體內cAMP含量造成影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與cAMP信號途徑關鍵基因在表達規(guī)律上存在一定的相關性，由此確定與病菌的cAMP信號途徑密切相關，該基因通過病菌cAMP信號途徑對病菌生長、發(fā)育和致病力的起調控作用。

圖6 cAMP途徑關鍵基因的RNAi突變體中BcKMO表達分析

利用real-time PCR技術，檢測突變體BCG183中cAMP信號途徑關鍵基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183中cAMP途徑關鍵基因、、、、的表達水平均明顯高于野生型和回復菌株，這說明基因突變上調、、、、的表達，表明負調控病菌cAMP信號途徑關鍵基因的表達。利用real-time PCR技術，檢測cAMP信號途徑關鍵基因、、、、的RNAi突變體中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在、的RNAi突變體中上調表達，在、、的RNAi突變體中均下調表達，表明、負調控的表達，、、正調控的表達。

研究結果確定了與病菌cAMP信號途徑密切相關，明確了與cAMP信號途徑關鍵基因、、、、之間的調控關系，但是通過cAMP信號途徑調控病菌生長、發(fā)育和致病力的分子機制尚未明確，需要進一步的深入研究。

4 結論

灰葡萄孢負調控cAMP途徑關鍵基因、、、、的表達。cAMP途徑關鍵基因、負調控的表達，而cAMP途徑關鍵基因、、正調控的表達。

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（責任編輯 岳梅）

Relationship between kynurenine 3-monooxygenase geneand cAMP signaling pathway in

YUAN Xuemei, WANG Min, ZANG Jinping, CAO Hongzhe, ZHANG Kang, ZHANG Jing, XING Jihong, DONG Jingao

(College of Life Sciences, Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology/Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory of Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to analyze the relationship betweenand cAMP signaling pathway in, and to lay a foundation for clarifying the molecular mechanism of thein growth, development and pathogenicityin. 【Method】A specific inhibitor SQ22536 of cAMP signaling pathway was used to detect the sensitivity of the wild-type strain BC22, theT-DNA insertion mutant BCG183, and thecomplementing mutant BCG183/. The cAMP was extracted from the wild-type strain BC22, theT-DNA insertion mutant BCG183, and thecomplementing mutant BCG183/and detected by using HPLC assay, respectively. Real-time PCR technology was used to detectexpression pattern of the,the PKA catalytic subunit geneand, the PKA regulatory subunit gene, G-protein Gsubunits geneandBC22. The expression level of cAMP signaling pathway key genes,,,, andmutants BCG183 and BCG183/was detected by using real-time PCR technology. The expression levelofin RNAi mutantsof cAMP signaling pathway key genes,,,, andwas detected by using real-time PCR technology.【Result】TheT-DNA insertion mutant BCG183 was insensitive to the cAMP signaling pathway specific inhibitor SQ22536. The inhibition rate of the cAMP signaling pathway specific inhibitor SQ22536 to mutant BCG183 was significantly lower than the wild-type strain BC22and thecomplementing mutant BCG183. The cAMP content of the mutant BCG183 was significantly lower than that of the wild-type strain BC22 and the mutant BCG183/. The expression pattern of, the PKA catalytic subunit gene, G-protein Gsubunits geneandwas basically the same, and the expression level of,,, andwas higher in 7th day of mycelia and sclerotia of BC22. In addition,the expression level ofand the cAMP signaling pathway key genes,,,, andwas higher in BC22 cultured on medium with fructose. The expression level of cAMP signaling pathway key genes,,,,strains BC22 and BCG183/. Theexpression level in the RNAi mutants ofandwas obviously higher than that of BC22, theexpression level in the RNAi mutants of,, andwas obviously lower than that of BC22.【Conclusion】Thenegatively regulated the expression of,,,, and. Theandnegatively regulated theexpression, and the,, andpositively regulated theexpression.

;; cAMP signaling pathway

2018-01-23；

2018-03-02

河北省自然科學基金（C2018204045）、河北省高等學?？茖W技術研究項目（ZD2016001）、河北省留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目（0316012）

袁雪梅，E-mail：2420788532@qq.com。王敏，E-mail：1546994436@qq.com。袁雪梅和王敏為同等貢獻作者。

邢繼紅，E-mail：xingjihong2000@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.006