吳至佛，姚曉藝，汪靈，鄧增艷，石靜，黃俊輝

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 腫瘤科，湖南 長沙 410008）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌分子學(xué)檢測已被臨床廣泛應(yīng)用。根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）表達(dá)情況以及乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)（Ki-67）的不同，臨床將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、Her-2型和三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）4個(gè)亞型[1]。其中，TNBC是一類特殊生物學(xué)行為的乳腺癌，約占乳腺癌的15%～20%[2]。綜述文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，TNBC多發(fā)生于絕經(jīng)前的年輕女性、黑色人種發(fā)病率高于白人、病理組織學(xué)分級高、侵襲性強(qiáng)、易早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后較差[3-6]，對ER及PR為受體的內(nèi)分泌治療無效[7]，Her-2為靶點(diǎn)的靶向藥物治療不敏感[8]。因此，除手術(shù)、放療之外，化療在TNBC的治療中顯得尤為重要。無論是TNBC還是非TNBC的化療，紫杉醇是重要的化療藥物之一[9]，但臨床經(jīng)常出現(xiàn)紫杉醇耐藥的現(xiàn)象[10]。腫瘤耐藥既是一種常見現(xiàn)象，又是一個(gè)復(fù)雜而尚未解決的難題，雖然有各種理論和推測解釋化療藥物耐藥的機(jī)制，但目前仍無根本性進(jìn)展。據(jù)報(bào)道[11]，腫瘤細(xì)胞的自噬（autophagy）與化療耐藥有關(guān)。目前，自噬與腫瘤發(fā)生及其耐藥研究越來越受到學(xué)者們的重視，已成為腫瘤耐藥機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一[12]。自噬相關(guān)基因8（autophagy-related gene 8，Atg8）在哺乳動(dòng)物被稱為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein1 light chain3，MAP1-LC3，簡稱LC3）[13]，對自噬泡的形成必不可少，是LC3是自噬的重要標(biāo)記物。有文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道肺癌A549細(xì)胞、人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞、卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SK-OV/DDP和乳腺癌MCF-7細(xì)胞的紫杉醇耐藥與自噬相關(guān)基因相關(guān)，但機(jī)制不清楚。為探討LC3在TNBC中與紫杉醇敏感性的關(guān)系，本研究以人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，研究不同濃度紫杉醇與LC3表達(dá)的關(guān)系，以及對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，為今后進(jìn)一步尋找紫杉醇耐藥靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231系由中南大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng)，LC3陽性細(xì)胞MCF-7為本實(shí)驗(yàn)建株，紫杉醇購自浙江海正制藥公司，熒光標(biāo)記Anti-LC3 A/B兔單克隆抗體、熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG-HRP購自南京賽泓瑞公司，Bax兔單克隆抗體、山羊抗鼠IgG-HRP、β-actin、山羊抗兔IgG-HRP購自SANTA公司，caspase-3兔單克隆抗體購自Abcam公司，LC3 A/B兔單克隆抗體購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1 mL/100 mL青鏈霉素的二抗混合液的高糖DMEM培養(yǎng)液，青鏈霉素混合液雙抗用于預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)菌污染。產(chǎn)品經(jīng)過濾除菌處理，可以直接添加到細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)。青霉素的含量為10 kU/mL，鏈霉素的含量為10 mg/mL。在細(xì)胞培養(yǎng)液中推薦的青霉素的工作濃度為100 U/mL，鏈霉素的工作濃度為 0.1 mg/mL。37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞傳代備用。

1.2.2 CCK-8法檢細(xì)胞增殖抑制 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，每孔約100 μL。分為實(shí)驗(yàn)組（MDA-MB-231細(xì)胞 +紫杉醇）和對照組（僅有MDA-MB-231細(xì)胞），根據(jù)紫杉醇濃度不同又將實(shí)驗(yàn)組分為0.5、1、2、5、10、20 μg/mL 6個(gè)亞組。每組設(shè)置 3個(gè)平行孔，置 37 ℃培養(yǎng) 48 h，每孔加入約 10 μL CCK-8 溶液，孵育1 h。將96孔板置于搖床充分混勻1 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下每孔的OD值，代入以下公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：腫瘤細(xì)胞增值抑制率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。繪制生長曲線，計(jì)算出紫杉醇對MDAMB-231細(xì)胞增殖的25%抑制濃度（IC25），用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫熒光法檢測LC3表達(dá) 為觀察紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞LC3表達(dá)的影響，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（MDA-MB-231+IC25濃度紫杉醇）和對照組（MDA-MB-231+高糖DMEM稀釋成工作濃度）。用胰蛋白酶-EDTA 溶液將實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞消化，離心，收集下層細(xì)胞沉淀。將收集的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液重懸、計(jì)數(shù)、調(diào)整好細(xì)胞密度。將調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液分別加入每個(gè)玻片培養(yǎng)小室，每個(gè)約1 mL，孵育24 h后在各組細(xì)胞中按設(shè)計(jì)方案加入紫杉醇，再次孵育72 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2min。3%多聚甲酸4℃下固定30min。PBS洗滌。加入一抗及熒光素標(biāo)記的相關(guān)二抗，室溫避光1 h，PBS 洗滌。每小室加入To-Pro3（1:1 000），室溫下避光 5 min，PBS洗滌。甘油封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。Motic Fluo 1.0軟件測定各組積分光密度值（integrated optical density，IOD）值。

1.2.4 Western blot檢測LC3表達(dá) 一抗LC3工作濃度為1:800，內(nèi)參β-actin為1:1 000，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體。按1.2.3方法設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對照組。取對數(shù)生長期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約1×107個(gè)/mL；0.25%胰蛋白酶消化，離心后收集到1.5 mL EP管中；加入細(xì)胞裂解液，超聲破碎儀進(jìn)一步破碎，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10～20 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，震蕩混勻。按 0、1、2、4、6、8、10 μL含量將其加到96孔板標(biāo)準(zhǔn)品孔中，每孔均用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到10 μL，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行孔；每孔加入 BCA工作液200 μL孵育30 min；多功能酶標(biāo)儀測量OD562nm波長時(shí)的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組蛋白濃度。以4:1的比例將剩余蛋白加入SDS上樣緩沖液，在100 ℃高溫放置5 min變性，SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將轉(zhuǎn)好的膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉。先后加入一抗、二抗孵育，室溫下TBST緩沖液洗膜3次，每次5～10 min；取ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。通過化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描圖像上的信號條帶，并用Image J圖像分析軟件對條帶灰度進(jìn)行數(shù)字量化，計(jì)算光密度值（optical density，OD）。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 凋亡相關(guān)蛋白與細(xì)胞凋亡檢測 將待檢細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組（MDA-MB-231+IC25濃度紫杉醇）、陽性對照組（LC3陽性MCF-7+IC25濃度紫杉醇）和陰性對照組（僅有MDA-MB-231）。參照1.2.4方法應(yīng)用Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、capase-3蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率。IC25濃度為紫杉醇工作濃度，Bax為1:300、capase-3為1:5 000，內(nèi)參β-actin為 1:1 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料兩組比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光法圖像采用Motic Fluo 1.0軟件處理測定各組IOD值、Western blot圖像灰度值采用Image J軟件分析、所有圖片通過GraphPad Prism 5軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

用不同濃度紫杉醇（0.5～20 μg/mL）處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，CCK-8法檢測細(xì)胞活性，繪制生長抑制曲線（表1）（圖1），結(jié)果顯示，隨著紫杉醇濃度增高，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加，呈濃度依賴性（P＜0.05），經(jīng)計(jì)算，紫杉醇IC25為3.11 μg/mL，選擇IC25作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

表1 不同濃度紫杉醇作用后的OD值與細(xì)胞生長抑制率（±s）Table 1 OD values and cell growth inhibition rates after treatment of different concentrations of paclitaxel(±s)

表1 不同濃度紫杉醇作用后的OD值與細(xì)胞生長抑制率（±s）Table 1 OD values and cell growth inhibition rates after treatment of different concentrations of paclitaxel(±s)

20 0.214±0.013 67.713±1.889

圖1 不同濃度紫杉醇下MDA-MB-231細(xì)胞生長曲線Figure 1 Survival curve of MDA-MB-231 cells under diあ erent concentrations of paclitaxel

2.2 紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞LC3表達(dá)的影響

應(yīng)用免疫熒光化學(xué)法和Western blot分別從定性與定量兩方面檢測紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞LC3表達(dá)的影響，在熒光顯微鏡下觀察（圖2），與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中代表LC3的紅色熒光亮度增多增強(qiáng)，主要分布于細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)中。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組IOD值較對照組明顯增高（P=0.0 018）。

LC3分為LC3A和LC3B兩種亞型，自噬時(shí)主要以LC3B形式存在。Western blot結(jié)果顯示，對照組LC3B/LC3A相對含量為0.9 657±0.0 685，實(shí)驗(yàn)組為1.6 394±0.0 282，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組LC3B/LC3A比例明顯提高（P=0.0 009）（圖3）。

圖2 免疫熒光法檢測LC3表達(dá)Figure 2 Immumofl uorescence staining for LC3 expression

圖3 Western blot檢測LC3蛋白表達(dá)Figure 3 Western blot analysis for LC3 protein expression

2.3 凋亡相關(guān)蛋白及細(xì)胞凋亡情況檢測

圖4 Western blot檢測Bax、caspase-3蛋白表達(dá)Figure 4 Western blot analysis for Bax and caspase-3 protein expressions

Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組Bax蛋白表達(dá)較陰性對照組明顯降低（P=0.0 005、0.0 004），而實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.2 847）；實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組caspase-3蛋白的表達(dá)也較陰性對照組低（P=0.0 034、0.0 032），而實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.9 599）（圖4）。

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總凋亡率為（10.21±0.03）%、陽性對照組為（11.99±0.15）%、陰性對照組為（25.06±0.03）% ，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組的細(xì)胞總凋亡率均低于陰性對照組（P=0.0 056、0.0 067）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期調(diào)亡率為（6.53±0.06）%、陽性對照組為（6.28±0.06）%、陰性對照組為（12.74±0.07）%，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組的早期調(diào)亡率均低于陰性對照組（P=0.0 035、0.0 039）。實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組細(xì)胞總凋亡率、早期凋亡率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.6 744、0.4 506）（圖5）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Figure 5 Apoptosis analysis by fl ow cytometry

3 討 論

乳腺癌已成為女性第一位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女的生命健康。其中TNBC約占所有乳腺癌的15%～20%，具有發(fā)病年齡較小、分化差、侵襲性強(qiáng)、容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后較差的特點(diǎn)。因缺乏ER、PR和Her-2表達(dá)，對以ER、PR為靶點(diǎn)的內(nèi)分泌治療和以Her-2為靶點(diǎn)的靶向藥物治療不敏感，成為臨床預(yù)后較差的乳腺腫瘤。TNBC除手術(shù)、放療外，化療是其主要治療手段之一。多個(gè)大型臨床研究和診療指南均推薦含紫杉類和（或）蒽環(huán)類的化療方案作為TNBC化療的首選方案[16-18]。本研究應(yīng)用CCK-8檢測人MDA-MB-231細(xì)胞對紫杉醇的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示隨著紫杉醇濃度的提高，MDA-MB-231細(xì)胞的增值抑制率逐漸增加，呈濃度依賴性，提示紫杉醇在體外細(xì)胞中能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。當(dāng)紫杉醇濃度為3.11 μg/mL，腫瘤細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到25%（IC25），與筆者前期實(shí)驗(yàn)相符[19]。文獻(xiàn)[11]報(bào)道和筆者的前期研究均證實(shí)，紫杉醇在用藥一段時(shí)間后出現(xiàn)藥物敏感性下降，產(chǎn)生耐藥性[20-22]，在一定程度上限制了紫杉醇在臨床中的應(yīng)用。

腫瘤耐藥是一個(gè)復(fù)雜的過程，雖然有多種學(xué)說解譯腫瘤細(xì)胞耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，但均未能完全解決問題。在已報(bào)道的眾多耐藥機(jī)制研究中，包括了腫瘤細(xì)胞的自噬。自噬是細(xì)胞維持自身穩(wěn)定性的生理過程，是溶酶體降解途徑，通過細(xì)胞的自噬作用而降解或清除不需要的代謝產(chǎn)物或（和）損傷的細(xì)胞器，或重新利用降解后的生物大分子和能量，以維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)[23]。根據(jù)自噬底物運(yùn)送至溶酶體腔方式的不同，自噬可分為大自噬（marcroautophagy）、小自噬（microautophagy）、分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）3種。自噬過程由自噬相關(guān)基因（autophagy associated gene，Atg）介導(dǎo)，多種上下游調(diào)控信號途徑傳導(dǎo)，主要有依賴mTOR（mammalian target of rapamycin，mTOR）和非依賴mTOR途徑，如Class III PI3K、P53、RAS-MAPK等[24]。Atg最初是在酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止已鑒定出30余種直接參與自噬形成以及調(diào)控的相關(guān)基因。LC3分為LC3I（或LC3A）和LC3II（或LC3B）2種形式，Atg7在Atg4的參與下活化形成LC3A，并在Atg3的協(xié)同下與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3B。LC3B具有融合特性，定位于自噬體膜上，可促進(jìn)自噬泡的延伸[14]，因此LC3是自噬的重要標(biāo)記物[25]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬參與多種生理病理過程，如組織發(fā)育、分化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除微生物，以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等[26-27]。正常情況下細(xì)胞的自噬作用主要是維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)，但在某些情況下，如饑餓、低氧、藥物等因素可以改變細(xì)胞自噬水平，使其提高或降低自噬能力。自噬與腫瘤的發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，化療、放療和內(nèi)分泌治療均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[28]。文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道顯示，在肺癌A549細(xì)胞、人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞、卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SK-OV/DDP、乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究中，均發(fā)現(xiàn)紫杉醇能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用免疫熒光法及Western blot檢測均證實(shí)，紫杉醇作用于MDA-MB-231細(xì)胞后，與對照組相比，自噬相關(guān)蛋白LC3 B/A的分布增多，含量增高，證實(shí)紫杉醇可誘導(dǎo)MDA-MB-231發(fā)生自噬。

為進(jìn)一步證實(shí)紫杉醇誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞上調(diào)LC3（LC3B/LC3A）的情況下，紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了不同情況下的MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡相關(guān)因子caspase-3及Bax蛋白水平表達(dá)和腫瘤細(xì)胞凋亡率。與未發(fā)生LC3蛋白表達(dá)變化的細(xì)胞組相比，實(shí)驗(yàn)組與LC3陽性細(xì)胞組的相關(guān)凋亡蛋白Bax和caspase-3降低，流式細(xì)胞術(shù)檢測早期凋亡率和總凋亡率下降，提示LC3的存在降低了紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞的敏感性。文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道，自噬相關(guān)蛋白LC3是一種微管結(jié)合蛋白，在自噬過程中LC3被轉(zhuǎn)化形成溶于細(xì)胞質(zhì)的LC3 A并被Atg5募集向自噬體膜，最后被轉(zhuǎn)化形成LC3B，定位于自噬體膜上募集脂質(zhì)分子，保證自噬體膜的進(jìn)一步擴(kuò)展并封閉。紫杉醇作用靶點(diǎn)是微管，誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)變化可能與此有關(guān)。

結(jié)合本研究和文獻(xiàn)報(bào)道資料，筆者認(rèn)為紫杉醇作為化療藥物，一方面對MDA-MB-231細(xì)胞有抑制作用，同時(shí)又能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞引起自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)變化，并在此基礎(chǔ)上可降低紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞的促調(diào)亡效應(yīng)。提示LC3可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的自噬而影響紫杉醇的耐藥性，可能作為未來研究TNBC紫杉醇耐藥，提高藥物敏感性的新靶點(diǎn)。

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