李小杰,李成軍,胡亞靜,李淑君,邱 睿,白靜科,陳玉國
(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 許昌 461000)
煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的危害世界煙草生產(chǎn)的重要根莖部細(xì)菌性病害,在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生,造成了巨大損失[1-2]。同時(shí)由于氣候等方面的原因,該病害已向北擴(kuò)展蔓延。截至目前,在河南、安徽、山東、陜西等地已有煙草青枯病的發(fā)生并造成不同程度的損失[3-6]。
在生產(chǎn)上防治煙草青枯病主要依賴化學(xué)農(nóng)藥,且到目前為止尚無有效的化學(xué)藥劑可防治青枯病。另外,大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅污染環(huán)境,而且破壞生態(tài)[7-8]。隨著煙草及其制品逐漸向綠色安全化方向發(fā)展,生物防治成為煙草病害防治研究的熱點(diǎn),尤其是全國煙草綠色防控重大專項(xiàng)的啟動(dòng)實(shí)施,為煙草病害的防治提供了新思路和新方法,為煙區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和生態(tài)環(huán)境安全提供了有力保障。
用于植物病害生物防治的因子有很多,總體來說主要包括拮抗微生物、抗生素和植物誘導(dǎo)因子等,其中拮抗微生物的種類主要有細(xì)菌、真菌、放線菌和病毒等。關(guān)于生防細(xì)菌的篩選,大多數(shù)是從土壤或健康植物根際土壤中分離,這些土壤微生物的拮抗效果常受到外界環(huán)境的影響而穩(wěn)定性較差[9]。目前利用內(nèi)生細(xì)菌防治煙草青枯病受到國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注,并有很多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-12],這些研究結(jié)果表明,大部分的內(nèi)生細(xì)菌不僅可以抑制病原菌生長,同時(shí)還具有促生作用等[13-14],且拮抗效果穩(wěn)定,具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。但這些生防菌大多還處于試驗(yàn)階段,實(shí)現(xiàn)商品化應(yīng)用的很少。因此,在不同生態(tài)環(huán)境及不同植物中挖掘和發(fā)現(xiàn)新的有益內(nèi)生細(xì)菌是很有必要的。豫南煙區(qū)是河南省煙草青枯病的發(fā)生區(qū),為了得到對煙草青枯病菌具有較好拮抗效果且穩(wěn)定的內(nèi)生細(xì)菌菌株,本研究對豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了大量分離篩選和鑒定,并對其拮抗效果進(jìn)行了初步分析,為河南煙區(qū)煙草青枯病的生物防治提供理論依據(jù)。
1.1.1供試煙草品種豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87,培育至5~6片真葉備用。
1.1.2供試菌株煙草青枯病菌菌株TXLLJ14-3由煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離純化,用30%甘油保存于-80 ℃冰箱。
1.1.3供試培養(yǎng)基拮抗細(xì)菌的分離、培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基,煙草青枯病菌的培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基。
1.1.4供試試劑拮抗細(xì)菌總DNA提取、16S rDNA片段擴(kuò)增所用試劑均購自天根生化科技有限公司。
1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化分別取健康煙草的根、莖0.1 g進(jìn)行表面消毒,然后用無菌水漂洗1次,再用有效氯為1%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min,立即轉(zhuǎn)入無菌水中漂洗4次。將消毒好的根或莖放入滅菌的研缽中進(jìn)行研磨,研磨液離心后取上清用無菌水進(jìn)行不同梯度的稀釋。取稀釋后的液體0.1 mL 涂布于LB培養(yǎng)基上,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)特征明顯不同的單菌落,于LB平板進(jìn)行劃線純化,將純化好的菌株保存于4 ℃冰箱備用。
1.2.2拮抗細(xì)菌的篩選將NA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右,按2%的比例加入過夜培養(yǎng)的煙草青枯病菌菌株TXLLJ14-3(濃度為1×1010cfu/mL),搖勻后倒平板,用無菌牙簽在每個(gè)平板上均勻點(diǎn)接5個(gè)左右的參試內(nèi)生菌株,置于恒溫培養(yǎng)箱中,28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察并測定抑菌圈直徑。選取抑菌圈明顯或?qū)Σ≡L影響較大的菌株保存?zhèn)溆?。?fù)篩方法同初篩,再次篩選抑菌圈大且效果穩(wěn)定的菌株。
1.2.3拮抗細(xì)菌的16S rDNA 鑒定用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA,并以細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物[4](F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)對菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為:Taq酶0.3 μL,10×Buffer(Mg2+)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,引物各1 μL,模板1 μL,ddH2O 17.2 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,56 ℃ 40 s,72 ℃ 90 s,28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,測序后將結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對,并選擇同源性較高的序列用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.4不同方式處理的拮抗菌Rsa3發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑制作用測定將拮抗菌Rsa3在LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h后,分別配制成拮抗菌LB發(fā)酵液(OD600=1.0)、拮抗菌無菌水懸液(OD600=1.0)、無菌發(fā)酵液(0.22 μm濾膜過濾),同時(shí)采用梯度稀釋法,分別制備10-1、10-2、10-3、10-4稀釋發(fā)酵液,用移液器吸取2 μL點(diǎn)接于含2%煙草青枯病菌的NA培養(yǎng)基平板上,置于恒溫培養(yǎng)箱中,28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察并測定抑菌圈直徑。
1.2.5盆栽接種試驗(yàn)將煙苗移栽于盛有無菌土的花盆中,5~7 d后每株澆10 mL拮抗菌發(fā)酵液100倍液(1×109cfu/mL),24 h后接種煙草青枯病菌,采用傷根灌根法,每株灌菌懸液(3×108cfu/mL)10 mL,設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)接種10株煙苗,3 d后再澆施1次拮抗菌發(fā)酵液,用量及濃度與第1次相同,以清水為空白對照。接種后觀察煙株的發(fā)病情況,其分級標(biāo)準(zhǔn)參照全國煙草行業(yè)煙草病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)YC/T 39—1996進(jìn)行。病情指數(shù)和防治效果按煙草病害藥效試驗(yàn)方法YC/T 40—1996計(jì)算。
青枯菌在煙苗組織內(nèi)的含菌量測定:于接種后15 d取樣,取樣部位為煙株莖基部。每0.1 g樣本加入1 mL無菌水進(jìn)行充分研磨,按10倍梯度稀釋,分別取不同稀釋液0.1 mL涂布于TTC培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),然后換算成每克鮮質(zhì)量青枯菌數(shù)。公式如下:
青枯菌活菌數(shù)(cfu/g)=
1.2.6拮抗細(xì)菌發(fā)酵液促進(jìn)煙苗根系生長的測定將中煙100的種子用拮抗菌發(fā)酵液(濃度為3×108cfu/mL)進(jìn)行浸種處理,然后置于MS培養(yǎng)基上,于(25±2)℃、光照12 h/d、光強(qiáng)3 000 lx條件下培養(yǎng)。待種子萌發(fā)后,用相同濃度的拮抗菌發(fā)酵液再噴霧1次,以清水作對照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。取生長20 d的幼苗,用直尺測量其根系長度。
使用分析軟件DPS 7.05進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。
采用平板梯度稀釋法共分離出208株內(nèi)生細(xì)菌菌株,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,共得到9株對煙草青枯病菌具有拮抗效果的細(xì)菌菌株,其編號分別為Rsa3、Rsa14、Rsa22、Rsa30、Rsa31、Rsa39、Rsa118、Rsa164、Rsa167,其中菌株Rsa3、Rsa22、Rsa30、Rsa39的拮抗效果較好(圖1),尤其以Rsa3的抑菌效果最好,抑菌圈半徑達(dá)到7 mm,且在轉(zhuǎn)移5~6代后,其抑菌能力無明顯變化。
將拮抗菌的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析,然后通過MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,篩選出的9株拮抗菌可歸為3個(gè)不同的屬。菌株Rsa3、Rsa22、Rsa30、Rsa31、Rsa39、Rsa164、Rsa167的16S rRNA基因序列與假單胞菌屬(Pseudomonas)同源相似度都在98%以上,其中拮抗效果最強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌菌株Rsa3與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)屬于同一進(jìn)化分支(圖2);菌株Rsa14的16S rRNA 基因序列與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)同源相似度為99%;菌株Rsa118的16S rRNA 基因序列與節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)同源相似度為93%。
圖1 煙草青枯病菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的平板篩選結(jié)果
不同方式處理的Rsa3拮抗菌發(fā)酵液對煙草青枯病菌的平板抑制效果不同,其中拮抗菌LB發(fā)酵液和拮抗菌無菌水懸液對煙草青枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用,而無菌發(fā)酵液對煙草青枯病菌幾乎沒有抑制效果(圖3A)。當(dāng)拮抗菌LB發(fā)酵液稀釋1 000倍時(shí),拮抗效果幾乎沒有變化,稀釋到10-5時(shí)對煙草青枯病菌仍具有抑制效果(圖3B)。由此可以說明,拮抗菌Rsa3對煙草青枯病菌具有較好的抑制效果,且其抑制作用主要在于菌體本身,而非其代謝產(chǎn)物。
選取對煙草青枯病菌拮抗作用最強(qiáng)的菌株Rsa3進(jìn)行盆栽接種試驗(yàn),從結(jié)果可以看出,接種后10 d,澆施拮抗菌發(fā)酵液處理的煙株未見發(fā)病癥狀。接種后15 d,澆施拮抗菌發(fā)酵液處理的煙株明顯比對照煙株發(fā)病輕(圖4A),拮抗菌Rsa3對青枯病的平均防治效果達(dá)79.17%(表1)。
圖2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
A:不同方式處理的Rsa3發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑制效果(1.拮抗菌Rsa3 LB發(fā)酵液;2.拮抗菌Rsa3 無菌水懸液;3.無菌發(fā)酵液);B:不同濃度的拮抗菌Rsa3 LB發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑制效果
A:接種后15 d不同處理的煙株發(fā)病情況;B:接種后15 d不同處理的煙株體內(nèi)菌量統(tǒng)計(jì)分析
處理接種后10 d發(fā)病率/%病情指數(shù)防治效果/%接種后15 d發(fā)病率/%病情指數(shù)防治效果/%Rsa30B0B100.0012.50B11.11B79.17CK80.00A26.67A-80.00A53.34A-
注:同列不同大寫字母表示差異達(dá)1%顯著水平。
接種后15 d煙株體內(nèi)的菌量分析結(jié)果表明,澆施拮抗菌發(fā)酵液處理的煙株體內(nèi)青枯病菌含量明顯比對照煙株體內(nèi)的青枯病菌含量低,且兩者之間具有極顯著差異(圖4B)。由此說明,拮抗菌Rsa3對煙草青枯病有較好的室內(nèi)防治效果,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
從圖5可以看出,煙草種子經(jīng)Rsa3發(fā)酵液處理后20 d,煙苗根系平均長度為6.0 cm,明顯比對照(平均根長為2.3 cm)長。結(jié)果初步表明,拮抗菌Rsa3具有促進(jìn)煙苗根系生長的能力。
圖5 拮抗菌Rsa3對煙苗根系的平板促生效果
本研究從豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87的根莖中分離煙草青枯病菌的拮抗內(nèi)生細(xì)菌,利用平板共培養(yǎng)法篩選出9株對煙草青枯病菌具有較好拮抗效果的細(xì)菌菌株,其中菌株Rsa3對煙草青枯病菌的抑菌效果最好,抑菌圈半徑達(dá)7 mm,且拮抗效果穩(wěn)定。通過分子生物學(xué)手段,將拮抗菌Rsa3鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。該菌對煙草青枯病菌有明顯的拮抗作用,且這種拮抗作用主要在于菌體本身,而非其代謝產(chǎn)物。拮抗菌Rsa3對煙草青枯病具有較好的防治作用,在溫室盆栽試驗(yàn)中防病效果達(dá)到79.17%,具有較大的應(yīng)用價(jià)值。
生物防治已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治有害生物的一項(xiàng)重要措施,目前青枯病的生物防治措施主要包括利用無致病力菌株和拮抗微生物等,其中利用拮抗菌對青枯病進(jìn)行防治的研究很多,尤其是內(nèi)生拮抗細(xì)菌[13,15-17]。但由于拮抗菌的生長容易受環(huán)境和寄主植物的影響,因此分離適合當(dāng)?shù)刂参锊『Ψ乐蔚霓卓咕潜匾陀幸娴摹1狙芯繌脑ツ蠠焻^(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87的根莖中分離篩選到9株對煙草青枯病菌具有拮抗效果的細(xì)菌菌株,為豫南煙區(qū)煙草青枯病的生物防治奠定了有力基礎(chǔ)。
目前研究報(bào)道,分離到的植物內(nèi)生細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)及短小桿菌屬(Curtobacterium)等,其中以芽孢桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌對植物病害防治的報(bào)道較多[18-21]。本研究分離篩選到9株煙草青枯病的拮抗內(nèi)生細(xì)菌菌株,其中有7株為假單胞菌屬,1株為節(jié)桿菌屬,還有1株為芽孢桿菌屬,這與前人的報(bào)道[18-21]一致,同時(shí)也初步說明防治豫南煙區(qū)煙草青枯病的拮抗內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種群為假單胞菌屬。本研究中屬于熒光假單胞菌的細(xì)菌菌株Rsa3對煙草青枯病菌的抑菌效果最好,且拮抗效果穩(wěn)定,同時(shí)對煙草青枯病具有較好的室內(nèi)防治效果,可作為煙草青枯病生防菌的候選資源。
有研究表明,假單胞菌的作用機(jī)制之一是通過可泌出胞外的細(xì)菌素、抗生素等次生代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)[22],其中假單胞菌中的著名抑菌活性物質(zhì)申嗪霉素在國內(nèi)已實(shí)現(xiàn)商品化[23-24]。但在本研究中,熒光假單胞菌Rsa3對煙草青枯病菌的拮抗作用主要在于菌體本身,而非其代謝產(chǎn)物,分析原因可能是不同地域、不同寄主植物中分離到的細(xì)菌菌株不同,其抑菌機(jī)制也就不同。
拮抗菌的防病和促生作用大都是相輔相成的,充分開發(fā)和利用自然界中的拮抗菌,可有效保護(hù)和促進(jìn)植物生長。本研究篩選獲得的拮抗細(xì)菌菌株Rsa3對煙草青枯病具有較好的抑菌和防病作用,同時(shí)對煙苗的根系有明顯的促生長效果,具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。