孫　備，沈　櫻，張　雪，蘇本卿，王國驕 ，郭　偉，周　斌

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866； 2.遼寧省水稻研究所，遼寧 沈陽 110101；3.遼寧省氣象科學(xué)研究所，遼寧 沈陽 110166)

競爭和化感是影響植物種間相互作用的重要途徑。無論是資源競爭，還是化感物質(zhì)干擾，土壤生態(tài)系統(tǒng)都是重要的媒介之一。事實上，植物能夠影響土壤生物和非生物的性質(zhì)，反過來影響植物本身和其他植物的生長，這種現(xiàn)象稱之為植物-土壤反饋[1]。植物-土壤反饋在植物種間關(guān)系、群落組成和演替以及生態(tài)系統(tǒng)功能等方面起重要作用[2-3]。在土壤生態(tài)系統(tǒng)眾多生態(tài)因子中，土壤養(yǎng)分和微生物與植物生長關(guān)系最為密切，二者是調(diào)節(jié)植物-土壤反饋的重要因素[4-5]。植物化感特性不同的生態(tài)型，對土壤生態(tài)系統(tǒng)特別是土壤生物的影響存在差異，這種差異將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的植物-土壤反饋過程[6-7]。因此，研究化感特性不同的生態(tài)型調(diào)節(jié)的土壤反饋對共存物種生長的影響，將有助于更好地揭示化感作用在植物種間關(guān)系中的意義。

水稻和稗草在稻田生態(tài)系統(tǒng)中長期共存。稗草能夠影響水稻生長，導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降，但不同水稻品種對稗草生長發(fā)育的影響也存在差異，特別是水稻化感品種可以顯著抑制稗草的生長[8-10]。水稻化感品種和非化感品種屬于不同的生態(tài)型。水稻化感品種能夠通過根分泌環(huán)己烯酮、二萜內(nèi)酯和黃酮甙元等化感物質(zhì)，直接抑制稗草的生長，提高自身對稗草的競爭力[11-12]。植物根分泌物是土壤有機物質(zhì)的主要來源之一[13]，能夠影響土壤微生物活動和土壤養(yǎng)分狀況，是調(diào)節(jié)植物-土壤反饋的重要因素[3,14]。水稻化感品種根分泌物不僅可以直接抑制稗草的生長，還能夠影響稻田土壤酶活性和土壤微生物群落[15-17]，但水稻化感品種和非化感品種土壤微生物群落的差異對水稻和稗草種間相互作用的影響尚不清楚。為此，研究水稻化感品種土壤微生物群落反饋對伴生稗草的影響，探討土壤微生物群落反饋對水稻和稗草種間相互作用的影響，以期揭示植物-土壤反饋在化感特性不同水稻品種與稗草種間關(guān)系中的作用。

1　材料和方法

1.1　試驗材料及試驗地概況

水稻化感品種選擇PI321777，來源于美國USDA-ARS種質(zhì)資源庫，是國內(nèi)外公認(rèn)的水稻化感品種。水稻非化感品種選擇遼粳9，通過特征次生物質(zhì)標(biāo)記和田間試驗方法評價確定為非化感品種，由遼寧水稻研究所提供。稗草(Echinochloacrusgalli)種子收集于中國科學(xué)院沈陽生態(tài)實驗站，自然風(fēng)干后在尼龍袋中保存。

試驗地位于中國科學(xué)院沈陽生態(tài)試驗站(41°31′N、123°24′E)，土壤類型為淋溶土(斑紋簡育濕潤淋溶土)。土壤基本理化性質(zhì)為pH值 6.54 ± 0.38、有機質(zhì)含量17.4 g/kg、全氮含量1.6 g/kg、速效氮含量178.14 mg/kg、全磷含量0.41 g/kg、速效磷含量70.04 mg/kg、全鉀含量1.20 g/kg、速效鉀含量 53.80 mg/kg。

1.2　樣品采集

1.2.1土壤樣品采集水田0～15 cm的表層土壤，過0.5 mm篩，備用。

1.2.2土壤接種物將預(yù)萌發(fā)的水稻和稗草種子直播于8 cm×12 cm的盆中，每盆裝入800 g土壤，每盆8穴，每穴2株。水稻生長至5葉期，取化感品種PI312777、非化感品種遼粳9和稗草根區(qū)土壤作為土壤接種物，并取樣測定土壤磷脂脂肪酸(PLFA)含量。

1.2.3根分泌物采用水培試驗收集水稻和稗草的根分泌物[12]。將水稻和稗草培養(yǎng)至4葉期，每種植物選擇根長和苗高相對一致的100株幼苗用于根分泌物的收集。將幼苗基部用海綿包裹后，插入泡沫板，放入盛有1/2 Hoagland培養(yǎng)液的水培容器(20 cm×12 cm×5 cm)中。將水培容器置于28 ℃、12 h光照的生長箱中培養(yǎng)，每24 h補充一次蒸餾水。5 d后將水培液用滅菌濾紙過濾，獲得化感品種PI312777、非化感品種遼粳9和稗草的根分泌物。

1.3　土壤PLFA含量測定

取5 g過篩凍干土壤，依次加入磷酸緩沖液、氯仿、甲醇(體積分別為4、5、10 mL)，提取 2 h，振蕩、離心后，提取CHCl3層，用氮氣吹干，過硅膠柱(美國Supelco生產(chǎn))，依次采用氯仿5 mL、丙酮10 mL、甲醇5 mL洗脫，收集甲醇相，吹干。再用氫氧化鉀-甲醇溶液進行皂化，最后用正己烷萃取，收集正己烷相，分離得到的脂肪酸甲酯用氣相色譜質(zhì)譜儀(GC-MS)測定。以正十九烷脂肪酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，各脂肪酸的識別與定量以細菌脂肪酸甲酯混標(biāo)和37種脂肪酸甲酯混標(biāo)確定。用11種脂肪酸 (i15∶0、a15∶0、15∶0、16∶0、i16∶0、16∶ω7c、i17∶0、17∶0、cy17∶0、cy19∶0、18∶3ω6) 表征細菌生物量。其中，i15∶0、a15∶0、i16∶0和i17∶0表征革蘭氏陽性細菌，16:1ω7c、cy17∶0、2-OH16∶0和cy19∶0 表征革蘭氏陰性細菌。真菌生物量通過18∶2ω6,9c、18∶ω9c和18∶ω9t計算，用10Me17∶0估算放線菌生物量[15]。

1.4　試驗設(shè)計

1.4.1不同來源土壤接種物和根分泌物對稗草生物量的影響將化感品種PI312777、非化感品種遼粳9和稗草的土壤接種物分別與滅菌土壤按1∶9的比例混合，然后裝入8 cm×12 cm的盆中，每盆裝800 g土壤，用來進行土壤接種物對稗草生物量的影響研究。在上述添加土壤接種物的基礎(chǔ)上，再分別對應(yīng)加入600 mL化感品種PI312777、非化感品種遼粳9和稗草的根分泌物，混合均勻，用來進行根分泌物對稗草生物量的影響研究。將稗草預(yù)萌發(fā)的種子播種于處理好的土壤中，每盆播種8穴，每穴1株，每個處理5個重復(fù)。植物出苗后35 d取樣，測定生物量。

1.4.2不同來源土壤接種物對混種水稻和稗草生物量的影響設(shè)置水稻、稗草單種以及水稻和稗草混種2種種植處理，將預(yù)萌發(fā)的水稻和稗草種子播種于含有不同土壤接種物的土壤中。每個處理5個重復(fù)?；旆N處理中，水稻和稗草按1∶混合種植。每盆播種8穴，每穴1株。水稻生長至5葉期時，分別收獲水稻和稗草，將地上和地下部分清洗干凈后，測定生物量。

1.5　數(shù)據(jù)處理

采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)比較不同處理對水稻和稗草生物量的影響，采用Tukey’s檢驗比較不同處理間的差異。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，圖表采用Excel 2007制作。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較不同來源土壤特征脂肪酸含量。土壤特征脂肪酸相對豐度的主成分分析(PCA)采用Statistica 6.0進行，并對特征脂肪酸相對豐度值進行對數(shù)轉(zhuǎn)化以滿足主成分分析數(shù)據(jù)正態(tài)分布的需要。通過對土壤接種物PLFA主成分得分進行多元方差分析(MANOVA)比較不同來源土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。主成分分析圖用SigmaPlot 12.0繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同來源土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異

采用15種相對含量比較高的脂肪酸來表征不同水稻品種和稗草根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)(表1)。由表1可知，水稻化感品種PI312777根區(qū)土壤總PLFA含量最低，稗草根區(qū)土壤總PLFA含量最高，稗草根區(qū)土壤總PLFA含量、細菌PLFA含量、真菌PLFA含量和放線菌PLFA含量均顯著高于PI31277根區(qū)土壤，但與非化感品種遼粳9根區(qū)土壤差異不顯著(放線菌PLFA含量除外)。不同來源的土壤真菌和細菌PLFA含量比值無顯著差異；不同來源的土壤革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌PLFA含量的比值不同，稗草根區(qū)土壤革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌PLFA含量的比值極顯著高于水稻根區(qū)土壤，2個水稻品種之間差異不顯著。

對水稻化感品種、非化感品種和稗草根區(qū)土壤微生物PLFA主成分分析(圖1)表明，第一主成分PCA1解釋了55.01%的變異，第二主成分PCA2解釋了16.87%的變異，二者累計解釋了71.88%的變異。15種脂肪酸與2個主成分的相關(guān)系數(shù)表明，飽和脂肪酸是影響土壤微生物群落的主要因素。第一主成分PCA1與飽和脂肪酸15:0、16:0呈顯著正相關(guān)，與飽和脂肪酸17:0呈顯著負相關(guān)。第二主成分PCA2與飽和脂肪酸14:0、i16:0、i17:0相關(guān)系數(shù)r>0.5。水稻化感品種、非化感品種和稗草根區(qū)土壤PLFA在主成分分析中各占不同的空間，化感品種PI312777根區(qū)土壤PLFA位于圖的右側(cè)，非化感品種遼粳9根區(qū)土壤PLFA位于圖的上方，而稗草根區(qū)土壤PLFA位于圖的左下方(圖1)。多元方差分析表明，水稻化感品種、非化感品種和稗草根區(qū)土壤微生物PLFA組成存在極顯著差異(P<0.001)，三者土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有所不同。

表1不同水稻品種和稗草根區(qū)土壤PLFA含量nmol/g

指標(biāo)PI312777遼粳9稗草細菌2.80±0.46bA3.39±1.06abA6.49±l.15aA真菌1.18±0.14bB1.50±0.33abAB2.74±1.20aA放線菌0.10±0.02bB0.11±0.02bB0.23±0.07aA真菌/細菌0.43±0.04aA0.45±0.06aA0.43±0.05aAG (+)/G (-)0.65±0.11bB0.75±0.07bB1.11±0.06aA總PLFA4.23±0.62bB5.15±1.40abAB9.73±4.43aA

注：同行數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母表示不同處理之間差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)。

交叉線表示原點(0,0)

2.2　不同來源接種物對稗草生物量的影響

不同來源的土壤接種物對稗草生物量的影響不同(圖2)。PI312777根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量高于稗草自身根區(qū)土壤接種物處理和遼粳9根區(qū)土壤接種物處理，但與遼粳9根區(qū)土壤接種物處理差異未達到顯著水平。添加根分泌物的PI312777根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量仍顯著高于添加稗草自身根分泌物的土壤接種物處理，但顯著低于添加根分泌物的遼粳9根區(qū)土壤接種物處理，表明添加根分泌物的化感水稻土壤接種物對稗草生長的促進作用低于非化感水稻土壤接種物，添加根分泌物影響了不同土壤接種物對稗草生長的反饋作用。

不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)，下同

2.3　混種條件下不同來源土壤接種物對水稻和稗草生物量的影響

2.3.1稗草由圖3可知，盡管單種條件下，PI312777根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量顯著高于稗草土壤接種物處理，但混種條件下PI312777根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量顯著低于稗草根區(qū)土壤接種物處理。無論是單種還是混種條件下，遼粳9根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量均高于稗草根區(qū)土壤接種物處理。不同來源土壤接種物處理條件下，與不同水稻品種混種對稗草生物量的影響也不同。與PI312777混種條件下，稗草根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量與單種相比降低40.67%，PI312777根區(qū)土壤接種物處理與單種相比降低70.29%。與遼粳9混種條件下，稗草根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量較單種降低18.09%，遼粳9根區(qū)土壤接種物處理較單種提高12.92%，且顯著高于稗草根區(qū)土壤接種物處理?？梢姡旆N條件下，遼粳9根區(qū)土壤接種物更有利于稗草的生長。

2.3.2水稻由圖4可知，無論是稗草根區(qū)土壤接種物處理還是PI312777根區(qū)土壤接種物處理，混種條件下PI312777生物量均顯著高于單種。但單種和混種條件下，PI312777根區(qū)土壤接種物處理PI312777生物量與稗草根區(qū)土壤接種物處理差異均未達到顯著水平。單種條件下，稗草根區(qū)土壤接種物處理遼粳9生物量與遼粳9根區(qū)土壤接種物處理差異不顯著；混種條件下，稗草根區(qū)土壤接種物處理遼粳9生物量較遼粳9自身根區(qū)土壤接種物處理顯著降低。對于稗草根區(qū)土壤接種物處理，混種條件下遼粳9生物量與單種差異不顯著；對于遼粳9根區(qū)土壤接種物處理，遼粳9混種生物量較單種顯著提高22.49%。

圖3　水稻和稗草根區(qū)土壤接種物對稗草生物量的影響

圖4　水稻和稗草根區(qū)土壤接種物對水稻生物量的影響

3　結(jié)論與討論

植物-土壤反饋是植物種間相互作用的重要機制。水稻化感品種和非化感品種調(diào)節(jié)的土壤反饋對稗草生長發(fā)育的影響不同，水稻化感品種根區(qū)土壤導(dǎo)致稗草生物量下降，調(diào)節(jié)不利于稗草生長的負反饋，而非化感品種對稗草生長無反饋影響[18]。調(diào)節(jié)土壤負反饋的機制包括資源的消耗、有害微生物的積累和化感作用[3,5]?，F(xiàn)有研究表明，土壤養(yǎng)分在水稻化感品種調(diào)節(jié)的不利于稗草生長的負反饋中的作用是有限的，土壤微生物在水稻化感品種與稗草種間相互關(guān)系中起重要作用[18]。本研究結(jié)果也表明，水稻化感品種、非化感品種和稗草根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，土壤真菌、細菌、放線菌以及總的PLFA含量明顯不同。但稗草單種條件下，水稻化感品種根區(qū)土壤接種物促進了稗草的生長，這與化感水稻根區(qū)土壤對稗草生長有負反饋影響的結(jié)果[18]相反。

土壤微生物多是依靠外源有機碳提供營養(yǎng)和能量維持生長的異養(yǎng)生物。根分泌物是土壤有機碳的重要來源之一，植物根分泌物的差異能夠影響土壤微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)[13]。水稻化感品種和非化感品種根分泌物的差異是影響二者根區(qū)土壤微生物群落差異的重要因素[17]。本研究中，化感水稻品種根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量高于非化感水稻品種根區(qū)土壤接種物處理，但添加根分泌物的化感水稻品種根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量顯著低于非化感水稻品種根區(qū)土壤接種物處理，表明化感水稻根分泌物能夠影響土壤微生物群落調(diào)節(jié)的反饋作用。水稻化感品種根分泌物對土壤PLFA組成的影響與其化感物質(zhì)對土壤PLFA組成的影響具有顯著的相關(guān)性[16]，水稻化感品種根分泌物對土壤微生物反饋的影響可能是化感物質(zhì)對微生物群落調(diào)節(jié)的結(jié)果。但化感物質(zhì)的半衰期相對比較短，不超過30 h[19]，在沒有水稻根分泌物持續(xù)輸入的條件下，不同水稻品種根分泌物對土壤微生物群落影響的差異會隨著時間的延長、化感物質(zhì)的降解而逐漸減小[15-16]。本研究采用近年來常用的土壤接種的方法研究土壤微生物群落的反饋作用，將不同來源的土壤接種物與滅菌土壤按1∶9的比例混合，從而有效地消除土壤養(yǎng)分差異對土壤微生物群落反饋的影響，但會增加反饋階段栽培植物對土壤微生物群落的調(diào)節(jié)作用[20]。本研究中，較少的土壤接種物的加入會減弱水稻化感品種根分泌物對土壤微生物群落的調(diào)節(jié)作用，土壤接種物處理微生物群落組成和結(jié)構(gòu)可能會受反饋階段種植的稗草根分泌物的影響。化感水稻根分泌物的添加能夠在生長前期影響化感水稻土壤接種物處理的土壤微生物群落，從而減弱反饋階段稗草對土壤微生物群落的影響，導(dǎo)致添加根分泌物的化感水稻土壤接種物處理稗草生物量顯著低于非化感水稻處理，與非化感水稻品種相比，調(diào)節(jié)了不利于稗草生長的負反饋。

在2個物種共存的系統(tǒng)中，共存植物對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，可能改變土壤反饋的強度和方向[21-23]。對于2個共存的物種，植物-土壤反饋在單種和混種條件下反饋的方向和強度可能不同，混種條件下土壤反饋的研究更有助于揭示植物-土壤反饋對植物生長及種間相互作用的影響[24-25]。本研究中，混種條件下，稗草根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量顯著高于化感水稻品種根區(qū)土壤接種物處理，顯著低于非化感水稻根區(qū)土壤接種物處理，表明混種條件下，化感水稻根區(qū)土壤微生物群落調(diào)節(jié)了不利于稗草生長的負反饋，非化感水稻根區(qū)土壤微生物調(diào)節(jié)了有利于稗草生長的正反饋，與單種條件下土壤微生物的反饋影響不同。這可能是由于在水稻和稗草共存的混種系統(tǒng)中，伴生水稻的存在能夠向土壤中持續(xù)輸入根分泌物，化感水稻根分泌物對土壤微生物的調(diào)控和影響加強，改變了單種條件下不同來源土壤接種物對稗草的反饋影響。

不同物種調(diào)節(jié)的土壤反饋的差異同樣能夠影響共存物種的競爭，土壤反饋對種間競爭的影響因物種而異，土壤反饋能夠增強或減弱物種的競爭力，也可能對競爭無影響[26-28]。本研究中，混種條件與單種條件相比，化感水稻土壤接種處理稗草生物量的降低顯著高于稗草自身土壤接種處理，化感水稻土壤接種物提高了水稻化感品種對稗草的競爭力。與非化感水稻混種，稗草根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量低于單種，非化感水稻根區(qū)土壤接種物處理稗草生物量高于單種，表明混種條件下，非化感水稻根區(qū)土壤接種物降低了自身對稗草的競爭力。不僅水稻化感品種和非化感品種調(diào)節(jié)的土壤微生物反饋對稗草的影響不同，二者對稗草根區(qū)土壤微生物反饋的響應(yīng)也存在差異。無論是單種還是混種條件下，稗草根區(qū)土壤接種物和化感水稻根區(qū)土壤接種物處理對水稻化感品種生物量的影響差異均不顯著，稗草根區(qū)土壤微生物對水稻化感品種無反饋影響。但非化感水稻品種自身根區(qū)土壤接種物處理混種水稻生物量高于單種處理，而稗草根區(qū)土壤接種物處理混種水稻生物量與單種處理差異不顯著，表明稗草根區(qū)土壤接種物降低了非化感水稻對稗草的競爭能力。土壤反饋和競爭相互作用表明，水稻化感品種根區(qū)土壤微生物群落調(diào)節(jié)了不利于稗草生長的負反饋，提高了自身對稗草的競爭力；非化感水稻品種根區(qū)土壤微生物群落調(diào)節(jié)了有利于稗草生長的正反饋，而稗草根區(qū)土壤微生物群落調(diào)節(jié)了不利于非化感水稻的負反饋，提高了稗草對非化感水稻的競爭力?；刑匦圆煌乃酒贩N對水稻和稗草共存系統(tǒng)中微生物調(diào)節(jié)的植物-土壤反饋的影響和響應(yīng)的差異能夠影響水稻和稗草的種間相互作用，水稻化感品種調(diào)節(jié)的植物-土壤反饋增強了其對稗草的抑制作用。

致謝：感謝中國科學(xué)院沈陽生態(tài)實驗站在試驗過程中提供的幫助。