龔立剛 王夢(mèng)萍 劉文俊 李 菲 任 斌

（1武漢市第八醫(yī)院病理科 湖北武漢 430010；2武漢市漢口醫(yī)院病理科 湖北武漢 430012）

結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，結(jié)直腸癌是男性第三位和女性第二位常見的惡性腫瘤［1］。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素之一，手術(shù)切除是其主要的有效干預(yù)手段，但未達(dá)20%的患者可有指征接受根治性肝切除術(shù)，大部分僅能進(jìn)行姑息性治療，其5年生存率低于 10%［2］。 斯鈣素 2 （Stanniocalcin 2，STC2）是一種糖蛋白分泌激素，在諸如乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)其明顯高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)［3］。因此本研究利用慢病毒載體將shRNA轉(zhuǎn)染入HCT116細(xì)胞以沉默STC2，構(gòu)建沉默STC2的HCT116細(xì)胞系，建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，分析STC2在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡的雄性 Balb/c裸鼠24只，體重 16～20 g，購自武漢市第八醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，均放置于SPF3級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，由武漢市第八醫(yī)院病理科提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清購自Hyclone公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；McCoy 5A培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胰蛋白酶（Trypsin）購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；瓊脂糖 （Agarose）購自Biowest Agarose公司；高效真核轉(zhuǎn)染試劑購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；雙熒光報(bào)告測(cè)試系統(tǒng)（Dual-LuciferaseReporter Assay System）購自 Promega公司；DNA Marker DL 2000購自寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶（KpnⅠ、Sal I等）購自Takara公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）購自Duchefa公司；DNA Marker DM8000購自全式金生物公司；dNTPs購自Takara公司；ExTaq DNA聚合酶購自Takara公司；Taq DNA聚合酶購自Fermentas公司；甘氨酸、三羥甲基氨基乙烷（Tris）購自Amresco公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、苯甲基磺酰氟 （PMSF）購自Promega公司；二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇購自武漢天源生物技術(shù)有限公司；Revert AidTM First Strand cDNA synthesis kit（#K1622）購自Fermentas公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自Biospin公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；HRP顯色試劑盒購自Millipore公司；Moncolonal Anti-STC2 antibody produced inmouse購自Sigma公司；Matrigel膠購自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 HCT116細(xì)胞用含10%FBS的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在高倍鏡下觀察，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，吸出原有舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗一遍后，加入含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使溶液覆蓋整個(gè)細(xì)胞面，在高倍鏡下觀察細(xì)胞變圓后吸出胰酶，再加入培養(yǎng)液基終止消化。用移液管輕輕吹打培養(yǎng)基，使細(xì)胞團(tuán)分散成單細(xì)胞懸液，并按照實(shí)驗(yàn)需要，接種2.5 mL細(xì)胞懸液于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分布均勻，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒 （Lentivirus）介導(dǎo)的基因沉默及驗(yàn)證根據(jù)pLL3.7載體及STC2基因上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)STC2敲降引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：lenti-STC2-F：TGTGGAGATGATCCATT TCATTCAAGAGATGAAAT GGATCATCTCCACTTTTTTC；lenti-STC2-R：TCGAGAAAAAAGTGGAG ATGATCCATTTCATCTCT TAGGTGAAATGGATCATCTCCACA。取pLL3.7-STC2 10 μL送上海美吉生物公司測(cè)序（正向、反向雙向測(cè)序）。打開DNAStar軟件中的Sequence程序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。點(diǎn)擊“File”中的“EnterSequence”導(dǎo)入測(cè)序結(jié)果，與NCBI網(wǎng)站上給出的STC2基因堿基序列進(jìn)行對(duì)比。選擇所測(cè)結(jié)果第40～50位堿基開始比對(duì) （測(cè)序結(jié)果從第40～50位堿基開始比較穩(wěn)定），結(jié)果提示測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站STC2的序列完全吻合。具體步驟：①實(shí)驗(yàn)組：200 μL無 血 清 DMEM 稀 釋 10 μg pLL3.7-STC2+5 μg pMDLg-pRRE+5 μg VSVG+5 μg pRSV-Rev。 對(duì)照組：200 μL 無血清 DMEM 稀釋 10 μg pLL3.7+5 μg pMDLg-pRRE+5 μg VSVG+5 μg pRSV-Rev。 ②100 μL無血清 DMEM 稀釋 7.2 μL VigoFect。 ③5 min后，將①、②溶液混合，室溫靜止15 min。④將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組250 μL質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物分別加入2盤10 cm皿的HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，做好標(biāo)記。⑤6～10 h后，移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED+10%FBS（從此刻開始算時(shí)間）。⑥轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達(dá)到70%以上，如未達(dá)到，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。⑦48 h后將2個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至2個(gè)15 mL離心管中，1 000 g離心5 min后，將上清轉(zhuǎn)移至2個(gè)新的15 mL離心管中，此時(shí)收獲含病毒的上清2管（沉默組 pLL3.7-STC2、對(duì)照組 pLL3.7-Con，每組2管），置于4℃冰箱備用。48 h之內(nèi)若觀察細(xì)胞狀態(tài)欠佳，可每孔加入1 mL的相應(yīng)完全培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定沉默STC2的HCT116細(xì)胞系（HCT116 pLL3.7-STC2、 HCT116 pLL3.7-Con）。

1.2.3 Western Blot驗(yàn)證沉默STC2效果 取6孔板中要收集的沉默STC2的細(xì)胞 （HCT116 pLL3.7-STC2、HCT116 pLL3.7-Con），去掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕輕洗滌一遍，然后將液體去除干凈。每孔樣品中分別加入300 μL RIPA裂解緩沖液+3 μL NaVO3+3 μL PMSF+3 μL PIC，置于冰上裂解 1～2 h，裂解在搖床上進(jìn)行。將6孔板內(nèi)細(xì)胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，10 000 g，4℃，離心15 min，取上清分裝后于-80℃保存。臨用前于10 000 g、4℃離心1 min取上清，用于Western Blot分析。采用Millipore的HRP顯色試劑盒進(jìn)行顯色，用凝膠掃描分析系統(tǒng)（LAS4000mini luminescent image analyzer）掃描存圖。

1.2.4 建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型 取雄性Balb/c裸鼠共 24 只，體重 16～20 g，6～8 周齡，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組各12只，分別以能穩(wěn)定沉默STC2的細(xì)胞HCT116 pLL3.7-STC2及細(xì)胞HCT116 pLL3.7-Con應(yīng)用脾臟注射并保留脾臟建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型參考文獻(xiàn)方法［4］并做適當(dāng)改進(jìn)，將測(cè)定細(xì)胞濃度為2.5×107/mL的癌細(xì)胞懸液 （實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別使用HCT116 pLL3.7-STC2細(xì)胞和HCT116 pLL3.7-Con）0.2 mL（5×106個(gè)）緩慢注射于脾內(nèi)，3～5 min 后見注射部位發(fā)白、腫脹后拔針，立即用酒精棉球按壓針眼直至無活動(dòng)性出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚，關(guān)腹。將小鼠置入溫箱中保暖，腹腔注射1%哌拉西林0.1 mL，蘇醒后給予葡萄糖鹽水飼養(yǎng)，繼續(xù)在SPF3級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC內(nèi)獨(dú)立飼養(yǎng)。3 w后頸脫臼處死后立即剖腹，觀察肝臟表面轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)數(shù)目、大小、位置，雙肺、大腸、小腸、腸系膜受累情況，有無腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹水，將轉(zhuǎn)移瘤用10%福爾馬林固定后石蠟包埋，連續(xù)組織切片，后行HE染色，光鏡下觀察，以明確肝轉(zhuǎn)移情況。雙肺及小腸均進(jìn)行病理學(xué)檢查，以明確有無轉(zhuǎn)移情況。

1.2.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶中白介素-10和VEGF的表達(dá) 將石蠟切片放置于染色架上，放在65℃烘箱中烘片2 h，待冷卻后脫蠟，然后將切片放入PBS中，在搖床上洗3次，每次5 min。在微波修復(fù)盒中配制少許的EDTA緩沖液，將切片放入其中，行微波修復(fù)，中火至緩沖液煮沸后斷電，間隔10 min后使用低火至煮沸。自然冷卻后使用PBS洗滌3次，每次5 min。將切片放置入3%過氧化氫溶液中，室溫下避開光線孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的作用。再用PBS洗3次，每次5 min，甩干后用組畫筆將組織圈起來，以防止之后步驟中組織上所孵育的液體流出，在組織上加適量的5%BSA然后封閉20 min。甩去BSA液，每張切片加入50 μL稀釋的一抗，完全覆蓋組織，在4℃環(huán)境里過夜。再用PBS洗3次，每次5 min。去除PBS液，每張切片加50～100 μL相應(yīng)種屬的二抗，在4℃環(huán)境里孵育50 min。PBS洗3次，每次5 min。然后去除PBS液，每張切片加50～100 μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色。觀察顯色完全后，使用蒸餾水或自來水沖洗，然后使用蘇木素復(fù)染，1%鹽酸短暫酒精分化數(shù)秒，用自來水沖洗，然后氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片經(jīng)過梯度酒精（70%～100%）10 min一個(gè)梯度，脫水干燥，二甲苯透明10 min，中性樹膠封固，鏡下觀察拍照。結(jié)果判定：根據(jù)IL-10和VEGF的分泌特點(diǎn)，陽性結(jié)果判定為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片取10個(gè)視野，使用專業(yè)圖像處理分析軟件Imageproplus 6.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)每個(gè)視野積分光密度值（IOD），以平均值作為每張切片的陽性細(xì)胞積分光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用（n）表示，采用Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行比較；計(jì)量資料采用（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 WesternBlot驗(yàn)證沉默 STC2結(jié)果HCT116pLL3.7-STC2細(xì)胞中STC2蛋白的表達(dá)量少于HCT116pLL3.7-Con，提示沉默STC2成功。見圖1。

2.2 兩組造模后肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成情況的比較 實(shí)驗(yàn)組肝轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生率為41.67%（5/12），對(duì)照組為91.67%（11/12），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Fisher檢驗(yàn)，P=0.027）。實(shí)驗(yàn)組肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量少于對(duì)照組（p＜0.05），兩組肝轉(zhuǎn)移瘤大小和肝臟重量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

圖1 Western Blot驗(yàn)證圖

2.3 IL-10和VEGF在轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達(dá)情況兩組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中IL-10的表達(dá)均為陽性，在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見有棕黃色染色顆粒，而在未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的正常肝臟中未見棕黃色顆粒，見圖2。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩組切片的陽性細(xì)胞積分光密度值分別為 （8 459.55±2 598.32）、（14 503.69±4 786.58）， 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=3.509，P=0.042）。兩組轉(zhuǎn)移瘤組織中VEGF的表達(dá)均為陽性，主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片的陽性細(xì)胞積分光密度值分別為（11 219.22±3 046.39）、（20 602.19±5 150.73）， 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=4.958，P=0.031）。

3 討 論

STC是一種最初在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，在魚的腮和腸道中起到抑制鈣攝取的作用，還能促進(jìn)腎臟對(duì)磷酸鹽的吸收。隨后有研究發(fā)現(xiàn)，人和其它哺乳動(dòng)物體內(nèi)也存在STC，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也有重要作用［3］。STC主要包括STC1和STC2兩種，研究證實(shí)人STC2基因定位于人染色體5q35.1，其序列中組氨酸和半胱氨酸的排列非常獨(dú)特，是區(qū)分其他STC的關(guān)鍵［5］。STC2廣泛存在于人體多種組織細(xì)胞中，但主要集中于腎臟的腎小管與集合管的主細(xì)胞和α閏細(xì)胞中以及十二指腸、腦、子宮、卵巢等組織中［5-7］。 已有研究顯示［6-8］，STC2 的不同表達(dá)水平對(duì)多種惡性腫瘤的進(jìn)展預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以等方面有一定的指導(dǎo)意義。Ieta［9］等通過基因芯片及qRT-PCR的方法檢測(cè)了139例結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁正常組織中STC2的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者中STC2的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度、腫瘤大小及AJCC分期有關(guān)，且STC2高表達(dá)的患者其總體生存率也低于低表達(dá)組。Hashemzadeh等［10］研究結(jié)果也表明，結(jié)直腸癌患者中STC2的表達(dá)水平比癌旁正常組織高，并且STC2的表達(dá)水平與腫瘤大小和病理分級(jí)有關(guān)。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組肝轉(zhuǎn)移率和肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量少于對(duì)照組的結(jié)果，則提示了沉默STC2后結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移能力的下降。

表1 兩組肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成情況的比較（）

表1 兩組肝臟轉(zhuǎn)移瘤形成情況的比較（）

觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組（n=12） 對(duì)照組（n=12） t P肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目/個(gè) 5.41±1.16 10.91±2.18 7.043 0.032肝轉(zhuǎn)移瘤體積/cm3 0.05±0.01 0.04±0.02 1.414 0.283肝臟重量/g 1.53±0.12 1.59±0.14 1.528 0.261

IL-10作為一種具有抗炎作用的抑制性細(xì)胞因子，廣泛參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生長和分化，抑制T細(xì)胞的殺傷功能，對(duì)IL-12、IL-18等促炎因子的作用有拮抗效應(yīng)，其所介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)將誘導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的免疫耐受，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［11］。IL-10 在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)［12］，術(shù)后患者血清中IL-10水平持續(xù)升高提示復(fù)發(fā)可能［13］，并且結(jié)腸癌患者血清中IL-10水平與預(yù)后有關(guān)，隨著IL-10水平升高，患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，癌細(xì)胞侵襲能力更強(qiáng)［14］。本研究中，實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝臟IL-10的表達(dá)水平低于對(duì)照組，或與其抗炎作用及誘導(dǎo)免疫耐受能力減弱，令更多的癌細(xì)胞在肝臟局部免疫微環(huán)境的作用下被殺傷，從而導(dǎo)致聚集和形成肝轉(zhuǎn)移灶減少有關(guān)。

腫瘤新生血管的形成是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟之一。腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及白細(xì)胞等都可以分泌釋放多種細(xì)胞活性因子，這些細(xì)胞因子可以調(diào)控并促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，其中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的細(xì)胞因子之一。多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF，其生成的VEGF通過旁分泌的方式作用于內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體，促進(jìn)腫瘤血管增生并誘導(dǎo)新生血管形成，與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)［15］。在結(jié)腸癌中，VEGF和其受體的高表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［16］研究結(jié)果表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF基因的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯升高。目前，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療中，以貝伐單抗為代表的抗血管生成的藥物主要集中于靶向VEGF及VEGF-R信號(hào)通路，通過阻斷VEGF所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤新生血管的形成，有利于降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，一定程度上可改善不可切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后［17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默STC2后肝臟轉(zhuǎn)移瘤VEGF表達(dá)水平低于未沉默者，與其肝轉(zhuǎn)移潛能的下降相符。

圖2 IL-10和VEGF在轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達(dá)情況（×400）

基于本研究，在裸鼠中將STC2沉默后結(jié)腸癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移潛能下降，且其肝轉(zhuǎn)移瘤中IL-10及VEGF的表達(dá)水平低于未沉默者，提示STC2或有望作為應(yīng)用于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移治療的潛在治療靶點(diǎn)之一。

［1］鄭樹，張?zhí)K展，黃彥欽.結(jié)直腸癌研究30年回顧和現(xiàn)狀［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2016，31（1）:2-5.

［2］中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)胃腸外科學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)結(jié)直腸肛門外科學(xué)組，中國抗癌協(xié)會(huì)大腸癌專業(yè)委員會(huì)等.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷和綜合治療指南（V2010）［J］.中華胃腸外科雜志，2010，13（6）:457-470.

［3］馬翔，陳雙倩，王國洲，等.斯鈣素2蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)及其臨床意義［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，（7）:1701-1703.

［4］王理，張文斌.結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2014，17（2）:162-165.

［5］ HASHEMZADEH S， ARABZADEH A A， ESTIAR M A，et al.Clinical utility of measuring expression levels of Stanniocalcin 2 in patients with colorectal cancer［J］.Medical Oncology，2014，31（10）:237.

［6］ NA S S， ALDONZA M B， SUNG H J， et al.Stanniocalcin-2 （STC2）:A potentiallung cancer biomarker promotes lung cancer metastasis and progression［J］.BiochimBiophys Acta，2014，1854 （6）:668-676.

［7］ LIN S， GUO Q， WEN J， et al.Survival analyses correlate sta nniocalcin 2 overexpression to poor prognosis of nasopharyngeal carcinomas［J］.Journal of Experimental&Clinical Cancer Research，2014，33:26.

［8］ ARIGAMI T， UENOSONO Y， ISHIGAMI S， et al.Clinical significance of stanniocalcin 2 expression as a predictor of tumorprogressioningastriccancer［J］.OncologyReports，2013，30（6）:2838-2844.

［9］ IETA K， TANAKA F， YOKOBORI T， et al.Clinicopathological significance of stanniocalcin 2 geneexpression in colorectal cancer［J］.Int J Cancer，2009，125（4）:926-931.

［10］ HASHEMZADEH S， ARABZADEH A A， ESTIAR M A，et al.Clinical utility of measuring expression levels of Stanniocalcin 2 in patients with colorectal cancer［J］.Medical Oncology，2014，31（10）:237.

［11］朱平，杜小萍，鞠吉雨，等.IL-10與疾病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.國際免疫學(xué)雜志，2012，35（1）:14-17，28.

［12］檀誼洪，邱萬壽，杜國能，等.小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移前肝臟Th1/Th2細(xì)胞因子的變化及與門靜脈IL-10、TGF-β1的相關(guān)性［J］.腫瘤防治研究，2012，39（10）:1166-1169.

［13］ MITEVA L D， STANILOV N S， DELIYSKY T S， et al.Significance of 1082A/G polymorphism of IL10，gene for progression of colorectal cancer and IL-10 expression［J］.Tumor Biology，2014， 35（12）:12655-12664.

［14］鄧菲丹，羅建業(yè).結(jié)腸癌組織IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（14）:60-63.

［15］王旭東，侯懿，陳靜，等.結(jié)腸癌組織中血小板應(yīng)答蛋白-1和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及其預(yù)后分析［J］.山西醫(yī)藥雜志，2017，46（16）:1932-1935.

［16］張子杰.結(jié)腸癌組織VEGF表達(dá)與樹突狀細(xì)胞浸潤的臨床意義及與血清VEGF濃度及其活化水平的相關(guān)性［J］.中國免疫學(xué)雜志，2015，31（9）:1257-1261.

［17］ LOUPAKISF，CREMOLINIC，MASIG，et al.Initial therapy with FOLFOXIRI and bevacizumab for metastatic colorectal cancer［J］.New England Journal of Medicine，2014，371（17）:1609-1618.