周聯(lián)明 張學(xué)利 單遠(yuǎn)洲 張吉發(fā) 朱光輝

（上海交通大學(xué)附屬六院南院上海奉賢區(qū)中心醫(yī)院普外科 上海 201499）

結(jié)腸癌是常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，臨床治療以手術(shù)為主，輔以結(jié)合放療和化療［1］，由于腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療不敏感而容易造成復(fù)發(fā)。基因治療作為一種新興的治療方法，其靶向性與安全性正逐漸引起人們的關(guān)注，極有可能成為未來(lái)腫瘤治療的發(fā)展趨勢(shì)。細(xì)胞凋亡在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色，與凋亡有關(guān)的基因或蛋白已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)［2］。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumornecrosis factor related apoptosis-inducingligand，TRAIL） 能選擇性介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)損傷，其抗腫瘤的優(yōu)勢(shì)已受到研究者的重視［3］。人端粒酶逆轉(zhuǎn) 錄酶 （human telmoerase reserse transcriptase，hTERT）是人端粒酶活性的中心，是最重要、最普遍的腫瘤特異性的生化標(biāo)志之一［4］。端粒酶的活化是細(xì)胞永生化和癌變的重要因素，由于端粒酶啟動(dòng)子僅能在腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄而在正常細(xì)胞中不啟動(dòng)，因此本研究通過(guò)觀察hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)TRAIL基因體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用，以期為結(jié)腸癌的靶向基因治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞所。Pshuttle載體和重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-GFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。RPMI1640購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）、碘化丙啶（PI）、LipofectamineTM2000 和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；PI試劑盒，MTT、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶購(gòu)自sigma；胰蛋白酶、DMSO購(gòu)自百靈威。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29復(fù)蘇后，置于在RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U/mL鏈霉素、100U/mL青霉素），在溫度37℃、CO2體積5%（v/v）的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，以4×105個(gè)/mL接種至6孔板，24 h后使用脂質(zhì)體Lifopect進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)設(shè)未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組；轉(zhuǎn)染pshuttle的空白質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染pshuttle-TRAI重組質(zhì)粒組以及轉(zhuǎn)染pshuttle-hTERT-TRAIL重組質(zhì)粒組。

1.2.3 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖變化 采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組接種于96孔培養(yǎng)板并調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為5.0×104/mL 每孔 100 μL，設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔。 于轉(zhuǎn)染 12、24和48 h后沒(méi)空加入MTT10 μL，培養(yǎng)箱設(shè)置溫度37℃、5%（v/v）CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，后棄上清液，添加100 μL DMSO溶解，避光震蕩15 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值，重復(fù)三次。計(jì)算細(xì)胞抑制率，重復(fù)三次。

1.2.4 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3.0×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種于24孔板中，培養(yǎng)12 h待完全貼壁厚進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8、16 h后移去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，PBS離心洗滌細(xì)胞，重懸于 500 mL緩沖液中。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 （0.5～1）×109細(xì)胞/L。 加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，混勻，避光室溫孵育 30 min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以（）表示，樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，并采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 載體的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 重組質(zhì)粒pshuttle-TRAIL的構(gòu)建與鑒定以pshuttle-hTERT-TRAIL質(zhì)粒為模板，用hTERT的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約為861 bp片段，見(jiàn)圖1；重組質(zhì)粒pshuttle-hTERT-TRAIL用Kpn I和Xho I雙酶內(nèi)切得到861和7480 bp 2個(gè)片段，見(jiàn)圖2；測(cè)序后經(jīng)Blast比對(duì)序列，正式插入片段與預(yù)計(jì)插入序列具有100%同源性。

圖1 PCR鑒別pshuttle-TRAIL

圖2 限制性內(nèi)切酶切鑒定pshuttle-TRAIL

圖3 PCR鑒別pshuttle-hTERT-TRAIL

圖4 限制性內(nèi)切酶切鑒定pshuttle-hTERT-TRAIL

圖5 熒光顯微鏡下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染圖（×200）

2.1.2 重組質(zhì)粒pshuttle-hTERT-TRAIL的構(gòu)建與鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pshuttle-hTERT-TRAIL分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，PCR擴(kuò)增得到398 bp片段；用Kpn I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定得到358 bp和7480 bp 2個(gè)片段，PCR和沒(méi)切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，見(jiàn)圖3、圖4。

2.2 重組質(zhì)粒對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

本研究將質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合形成復(fù)合體，轉(zhuǎn)染24 h后于OlympusCKX41熒光顯微鏡下觀測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞可觀察到明亮綠色熒光，證明該方法可行。分別選用質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1:1，1:1.5，1:2，1:2.5，1:3，1:3.5 的梯度比例檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染比例，通過(guò)熒光強(qiáng)弱判斷轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果當(dāng)質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:3時(shí)熒光效率最高，視野中超過(guò)50%細(xì)胞顯示綠色熒光，因此確定質(zhì)粒與脂質(zhì)體最佳比例為1:3，見(jiàn)圖5。

2.3 轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在12 h、24 h和48 h時(shí)的OD值空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)pshuttle-TRAIL組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，與空質(zhì)粒組比較，OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均p＜0.05）；pshuttle-hTERT-TRAIL重組質(zhì)粒組細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最為明顯，與pshuttle-TRAIL比較，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖6 流式細(xì)胞檢測(cè)HT-29細(xì)胞凋亡

表1 各組細(xì)胞OD490值比較（）

表1 各組細(xì)胞OD490值比較（）

與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較*p＜0.05；與pshuttle-TRAIL重組質(zhì)粒組比較，#p＜0.05。

組別 空白對(duì)照 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 pshuttle-TRAIL重組質(zhì)粒組 pshuttle-hTERT-TRAIL重組質(zhì)粒組12 h 0.45±0.03 0.42±0.03 0.39±0.02* 0.35±0.02*#24 h 0.56±0.03 0.52±0.02 0.41±0.03* 0.37±0.02*#48 h 0.64±0.04 0.64±0.03 0.56±0.04* 0.51±0.01*#

2.4 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡率的變化 四組細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pshuttle-TRAIL重組質(zhì)粒組和pshuttle-hTERT-TRAIL重組質(zhì)粒組凋亡率分別為6.48%、7.74%、24.93%、30.65%，pshuttle-TRAIL 重組質(zhì)粒組和pshuttle-hTERT-TRAIL重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 （均p＜0.05）。見(jiàn)表2及圖6。

表2 轉(zhuǎn)染后對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡率的影響（%，）

表2 轉(zhuǎn)染后對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡率的影響（%，）

與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，*p＜0.05；與pshuttle-TRAIL重組質(zhì)粒組比較，#p＜0.05；與空白對(duì)照組比較，△p＜0.05。

組別 凋亡率空白對(duì)照 6.18±1.12空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 7.74±1.52 pshuttle-TRAIL 重組質(zhì)粒組 24.93±4.12*△pshuttle-hTERT-TRAIL 重組質(zhì)粒組 30.65±5.67*#△

3 討 論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在北美、澳洲和西歐具有較高的發(fā)病率，死亡率僅次于胃癌，而在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。目前結(jié)腸癌臨床治療方式多樣化，首選結(jié)腸腫瘤根治術(shù)，同時(shí)結(jié)合術(shù)后放療和化療。然而結(jié)腸癌手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移十分常見(jiàn)，有研究指出結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)60%，結(jié)腸癌患者死亡的主要原因是術(shù)后癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)［5］。因此，探索新的治療方法以有效延長(zhǎng)癌癥患者生存期成為腫瘤治療的一大目標(biāo)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)研究的深入，基因治療開(kāi)始受到人們的關(guān)注［6］。

基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的［7］，也就是將外源基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入患者適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說(shuō)，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)?；蛑委熍c常規(guī)治療方法不同，一般意義上疾病的治療針對(duì)的是因基因異常而導(dǎo)致的各種癥狀，而基因治療針對(duì)的是疾病的根源——異常的基因本身［8］。其中，體細(xì)胞基因治療是基因治療的一種形式，已成為研究的熱點(diǎn)。

TRAIL基因廣泛分布于人體多個(gè)器官，是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（TNF）家族的又一成員，但與TNF家族其他成員不同的是，TRAIL是由三個(gè)單體通過(guò)230位半胱氨酸 （Cys230）螯合一個(gè)鋅離子（Zn2+）形成的三聚體，這個(gè)結(jié)構(gòu)對(duì)誘導(dǎo)腫瘤凋亡有著重要的意義［9］。TRAIL誘導(dǎo)腫瘤凋亡通過(guò)死亡受體途徑、線粒體途徑和旁路激活途徑實(shí)現(xiàn)，具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)腫瘤凋亡的能力，但對(duì)正常細(xì)胞基本無(wú)影響。與TNF家族的另外兩個(gè)成員FasL和TNF-α相比，TRAIL不表達(dá)于免疫細(xì)胞，對(duì)核因子NF-κB也僅有很微弱的激活作用，因此不會(huì)像TNF-α那樣產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，而且比FasL有更廣的抗癌譜［10-11］。因TRAIL表達(dá)于人體多個(gè)器官，因此需在較大濃度下發(fā)揮效應(yīng)，但近期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRAIL使用過(guò)量也會(huì)引發(fā)正常細(xì)胞凋亡，因此降低TRAIL對(duì)正常組織的毒副作用及增強(qiáng)靶向性成為亟待解決的問(wèn)題［12-13］。

端粒酶是目前發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤最廣譜的分子標(biāo)記物，可在絕大多數(shù)腫瘤中被激活［13］。在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中hTERT的活性顯著升高，而hTERT基因啟動(dòng)子對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性，可靶向端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因表達(dá)，避免對(duì)正常細(xì)胞造成殺傷，是進(jìn)行基因治療新的理想靶點(diǎn)［14］。近年來(lái)利用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控溶瘤病毒、凋亡基因、抑癌基因和自殺基因等抗腫瘤基因，均在實(shí)驗(yàn)中顯現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用［8，15-16］。

本研究通過(guò)構(gòu)建pshuttle-hTERT-TRAIL特異性基因治療載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞系中，在MTT實(shí)驗(yàn)中觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，且具有時(shí)間依賴(lài)性，在與空白對(duì)照和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的比較中，轉(zhuǎn)染pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL質(zhì)粒的細(xì)胞受抑制作用更加明顯。通過(guò)流式細(xì)胞法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞凋亡率，空白對(duì)照組與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯低于pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL組，而pshuttle-hTERT-TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用最為明顯，體現(xiàn)了端粒酶啟動(dòng)子的靶向性。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TRAIL基因載體，證明其具有靶向結(jié)腸癌細(xì)胞的能力，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明該載體具有抑制腫瘤生長(zhǎng)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，可為未來(lái)結(jié)腸癌的基因治療提供一定的理論依據(jù)。

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